Автор работы: Пользователь скрыл имя, 24 Марта 2012 в 19:56, статья
Анализ белковых гидролизатов проводят следующим образом. Утром включают анализатор, нагревают до рабочей температуры термостат и баню реактора, готовят буферные растворы и реагенты. При этом вначале удаляют из колонки избыток буферного раствора, а затем пипеткой с тонким концом осторожно ( по стенке) вводят раствор образца. Впитывание образца проводят при избыточном давлении газа ( азот или воздух) 0 3 атм. По установлении рабочего давления определяют скорость потока в системе. Через час включают насос подачи нингидринового реагента.
Анализ белковых гидролизатов проводят следующим образом. Утром включают анализатор, нагревают до рабочей температуры термостат и баню реактора, готовят буферные растворы и реагенты. При этом вначале удаляют из колонки избыток буферного раствора, а затем пипеткой с тонким концом осторожно ( по стенке) вводят раствор образца. Впитывание образца проводят при избыточном давлении газа ( азот или воздух) 0 3 атм. По установлении рабочего давления определяют скорость потока в системе. Через час включают насос подачи нингидринового реагента. К этому времени все кислые и нейтральные аминокислоты уже элюированы из колонки. После установления рабочего давления определяют скорость потока и включают самописец.
Одноколоночный анализ белковых гидролизатов и физиологических жидкостей проводят по единой схеме на колонке 0 9 X Х133 см при 60 С. Поскольку элюирование ведут в градиенте буфера, используют нингидриновый реагент с большей буферной емкостью.
Для анализа белковых гидролизатов разработаны очень удобные хроматографические методы. Тем не менее электрофорез, особенно электрофорез на бумаге, очень часто применяют, когда смеси не очень сложны и когда имеющиеся в смеси аминокислоты значительно отличаются по кислотно-основным свойствам. Электрофоретическое разделение аминокислот можно провести очень быстро, особенно если применить высоковольтный электрофорез. Проявление электрофореграмм осуществляют с помощью нингидрина.
Аминокислотный состав устанавливается путем анализа пептидных и белковых гидролизатов в основном хроматографическими методами. В настоящее время такой анализ осуществляется с помощью аминокислотных анализаторов.
Метод анализа физиологических жидкостей в действительности является расширенным вариантом метода анализа белковых гидролизатов; он позволяет разделить более 50 аминокислот или родственных соединений, тогда как по методу анализа белковых гидролизатов удается определить 20 обычных аминокислот. Поэтому при выборе метода анализа нужно принимать во внимание не источник взятия пробы, а ее подлинность и состав. Пробный анализ следует проводить по такой методике, чтобы можно было полностью количественно определить все аминокислоты, которые предполагаются в пробе.
Новая модель TSM ( Technicon Seguential Multi-Sample Amino Acid Analyzer) представляет собой автоматизированный прибор, презназначенный для разделения, детектирования и идентификации аминокислот в растительных и животных тканях и жидкостях. Время анализа белковых гидролизатовсоставляет здесь 15 мин, а смеси аминокислот из физиологических жидкостей и экстрактов тканей - 5 ч 30 мин. После ручной зарядки восьми патронов анализ 40 образцов проводят в автоматическом режиме. Анализ осуществляется по двухколоночной схеме; по чувствительности прибор идентичен модели NC-2. Он укомплектован множеством колонок, смол и других принадлежностей.
Увеличение концентрации соли вызывает постепенный дрейф базовой линии, что связано с присутствием в исходных реактивах аммиака, некоторых катионов и других веществ. Для анализа белковых гидролизатов разделяющей способности этой колонки вполне достаточно, однако ее не хватает для разделения более сложных смесей.
Сравнительно недавно синтезирована смола типа UR-40, которая позволяет определять кислые и нейтральные аминокислоты по методике анализа физиологических жидкостей за 170 мин на колонке высотой 26 см. Основные аминокислоты физиологических жидкостей также могут быть определены на этой же колонке за 210 мин. Одноколоночный метод анализа белковых гидролизатов на этой смоле описан в разд. Использование более коротких колонок и улучшение разделения пиков аминокислот стало возможным благодаря устранению специфических перемешивающих узлов (таких, как реактор, подводящие трубки, краны и кюветы), имеющихся в большинстве приборов.
Для этой цели можно использовать ту же колонку длиной 56 см, которая применяется для анализа белковых гидролизатов. Заполнение колонки описано в разд.
Таким образом, на базе аминокислотного анализатора был создан прибор, удовлетворяющий современным требованиям - автоматический аминокислотный анализатор. По сравнению с анализом белковых гидролизатов в этом случае предъявляются гораздо более высокие требования к эффективности разделения, поскольку приходится анализировать смеси очень сложного состава. Наряду с аминокислотами такие смеси включают вещества самой разной природы; их единственным общим свойством является способность давать положительную реакцию с нингидрином. С целью повышения эффективности анализ в данном случае проводят на более длинной колонке. Естественно, что такой анализ требует большего времени, чем анализ белковых гидролизатов, и особой системы буферных растворов. Источники свободных аминокислот существенно различаются в количественном и качественном отношении, и, следовательно, каждую конкретную смесь приходится анализировать в особых, нестандартных условиях.
Для одноколоночного хроматографического анализа кислых, нейтральных и основных аминокислот белковых гидролизатов используется такая же колонка высотой 26 см, которая была описана применительно к более сложному анализу физиологических жидкостей. При использовании трех натрийцитратных буферов весь анализ занимает 170 мин. Описанный ниже метод с применением трех буферов позволяет проводить весь анализ при одной температуре. Однако можно осуществить анализ белковых гидролизатов, используя вначале методику анализа для кислых и нейтральных аминокислот физиологических жидкостей. Эта методика дает возможность определять не только обычные аминокислоты, содержащиеся в белковых гидролизатах, но также и необычные или неизвестные аминокислоты при минимальном перекрывании пиков.