Методы исследования поведения млекопитающих

1 Методы исследования поведения млекопитающих

1.1 Методы исследования безусловнорефлекторной деятельности

1.2 Методы исследования двигательной активности

1.3. Методы исследования памяти и обучения

1.4 Методы исследования работоспособности

1.5 Методы исследования социального и агрессивного поведения

1 Методы исследования поведения млекопитающих

1.1 Методы исследования безусловнорефлекторной деятельности

Исследование силы хватки (Grip strength)

Тест «сила хватки» используется для оценки состояния срединного нерва, который у крыс отвечает за хватку передних конечностей, иннервируя все сгибатели пальцев и flexor carpi radialis.

У крыс очень цепкие передние конечности, которыми они манипулируют едой при охоте и добыче корма. Их можно обучить доставать и зажимать предметы различной формы и размеров. Это используется, например, при выработке инструментальных условных рефлексов [Nichols et al., 2005]

Собственно тест проводится с помощью динамометра и решетки, за которую цепляется животное. Крысу поднимают за хвост, она цепляется и ее продолжают поднимать, замеряя масимальные показания динамометра (в тот момент, когда животное отцепляется). Изменение силы хватки интерпретируется как признак моторной нейротоксичности [Bertelli, 1995]

1.2 Методы исследования двигательной активности

Открытое поле

Тест «открытое поле » применяется для исследования общей двигательной активности, исследовательского поведения и эмоциональности. В классическом виде [Hall, 1934]⁠  установка представляет собой равномерно освещенную арену, поделенную на равные квадраты.В узлах пересечений располагаются круглые отверстия — «норки». В центр ее помещается животное. Затем в течение 5 минут регистрируются горизонтальная активность (число пересеченных квадратов), исследовательская активность (количество стоек на задних лапах и количество заглядываний в норку), количество актов груминга, эмоциональность животного (акты дефекации и уринации). Тест также активно используется для изучения тревожности и  памяти [Амикишиева, 2009].

1.3. Методы исследования памяти и обучения

Декларативная память заключается в преобразовании беспорядочного массива воспоминаний о фактах и событиях в такой вид, где эти выученные элементы организуются при помощи смысловых связей.  В процессах распознавания происходит обращение к массиву для идентификации прежде встреченного обьекта, пространственная память требует способности запоминать посещенные места. Распознавание и пространственная память являются как формами декларативной памяти у людей, так  и  самыми наиболее часто изучаемыми примерами памяти у грызунов [Clark, Martin, 2005]⁠.

Водный бассейн Морриса (Morris Water Maze)

Водный лабиринт Морриса был предложен в 1984 году как метод для изучения пространственной памяти крыс [Morris, 1984]⁠. В настоящее время его используют для оценки возрастных и патологических изменений (в т.ч. экспериментальных), эффектов лекарственных средств. Тест имеет несколько преимуществ: во-первых, грызунов не нужно обучать плаванию и они способны длительное время продержаться на воде. Тест основан на естественном стремлении животного выбраться из воды. Во-вторых, не требуется специальной мотивации вроде стресса, голода или жажды. В-третьих, есть возможность различения когнитивных процессов (обучения и памяти) и физических возможностей. Кроме того, не задействуется обоняние (которое очень сильно развито у крыс) [Choi et al., 2006]⁠.

Крыса помещается в центр круглой емкости с водой, откуда может выбраться только на платформу, которая находится под водой и изначально невидима для животного. Емкость мысленно делят на четыре квадранта (в некоторых исследованиях добавляют две концентрических секции). Вода окрашивается,например, путем добавления сухого молока, диоксида титана, белой краски, и т.д. Температура воды  - от 18 до 26 ° С, размеры бассейна — 0,8-2,20 м в диаметре, 0,25- 0,4 м уровня воды. Размеры платформы от 9х9 до 12х12 см, в случае круглой платформы — диаметром 9-12 см.  Обычные здоровые крысы очень быстро учатся доплывать до платформы от любой точки бассейна. Параметры эффективности обучения: направление, латентный период нахождения платформы и траектория плавания, если платформа каждый раз размещается в другом месте.

Крысы способны быстро обучиться находить предмет, который они никогда не видели, слышали или обоняли за счет неподвижных меток на бассейне или интерьера лаборатории [Brandeis, Brandys, Yehuda, 1989]⁠⁠.

Кроме статичной платформы, используемой в классическом варианте теста Морриса, есть также т.н. Atlantis platform – платформа, которая появляется, если животное провело определенное время внутри зоны платформы. Платформа остается невидимой, так как располагается под поверхностью воды, но, наткнувшись на нее, крыса может выбраться из бассейна [Buresova et al., 1985; Spooner et al., 1994]

На прохождение теста влияют масса тела, физическое состояние и возраст животного. Кроме того, самцы лучше справляются с тестом, чем самки, что говорит не столько о физических возможностях, сколько о лучшем ориентировании в пространстве. Хотя в возрасте 6 месяцев различия исчезали [Bucci, Chiba, Gallagher, 1995]⁠. Хотя это может зависеть от гормонального статуса — низкий уровень эстрогена положительно влияет на ориентировку в пространстве и наоборот [Coluccia, Louse, 2004]⁠. Исследования на самцах показали циркадианные изменения во времени выполнения задания, которые, вероятно, связаны с значительными флуктуациями концентрации тестостерона в крови [James, Kimura, 1997]⁠. Самки, получавшие инъекции тестостерона, справлялись с заданием лучше [Healy, Braham, Braithwaite, 1999]⁠.

В целом крысы справляются с тестом лучше, чем мыши, во-первых, они лучше плавают, во-вторых, из-за мышиного тигмотаксиса, из-за которого мыши стремятся держаться преимущественно бортика бассейна. Хотя в других видах тестов существенных различий между мышами и крысами не  наблюдается [Whishaw, Tomie, 1996]⁠. Возраст животного также играет роль — отмечается, что способность к обучению с возрастом падает, так же, как падают способность удерживаться на плаву, исследовательское поведение и локомоторные навыки, которые необходимо отличать от когнитивных расстройств, которые могут присутствовать у старых животных [Paul, Magda, Abel, 2009]⁠.

Недостатки этого теста:

1. Некоторые исследователи рассматривают погружение в воду как стрессогенный стимул и считают нужным перед тестированием давать животным привыкнуть к водной среде. Но в этом случае в результатах теста можно усомниться. К тому же влияние стресса никогда нельзя игнорировать, даже если считать, что предварительное привыкание снижает его до приемлемого уровня.
2. Погружение в воду может быть некомфортной для животных, если она будет слишком холодной, например. Если это не контролировать, могут появиться респираторные, глазные и другие инфекции [D'Hooge, De Deyn, 2001]⁠.
3. Хотя сам бассейн достаточно прост и дешев, обработка результатов требует видеозаписывающей системы и программного обеспечения.

Преимущества:

1. Обучение протекает быстрее, чем в других лабиринтах. Обучение 1 крысы занимает 1-2 минуты в день, в среднем животному требуется 5 попыток [Hodges, 1996]⁠.
2. Результаты представляют собой точные и воспроизводимые данные о долговременной памяти, рабочей пространственной памяти и обучении [Dudchenko, 2004]⁠.
3. Не требуется никакой подготовки (водной или пищевой депривации).
4. Вероятность того, что животные будут использовать обонятельные метки, как они это делают в сухих лабиринтах, отсутствует.
5. Бассейн Морриса адекватно используется при моделировании различных заболеваний, таких, как цереброваскулярная болезнь, нарушения развития мозга, метаболические нарушения, болезнь Альцгеймера и др. Кроме того, его используют для тестирования трансгенных мышей, что позволяет интерпретировать результаты теста как когнитивные и некогнитивные компоненты мутации [Paul, Magda, Abel, 2009]⁠.

Лабиринт Барнеса (Barnes' maze)

Тест позволяет оценить обучение, рабочую и долговременную память.

Животное помещается на круглую открытую приподнятую над полом платформу. Ему предьявляется раздражающий стимул в виде яркого света,вентилятора или сильного шума (некоторые исследователи считают, что вентилятор является сильным стрессирующим фактором, а яркий свет препятствует четкой записи видео). В ответ животное вынуждено выбирать убежище — 1 из 18 отверстий вокруг платформы. Размеры лабиринта: диаметр платформы — 92 см, цвет ее берется в зависимости от цвета животного (для автоматической обработки необходимо, чтобы животное хорошо выделялось на фоне). Платформа содержит 18-20 отверстий, каждое 5 см. диаметром, расположенных по краю платформы на расстоянии 7,5 см. Лабиринт приподнят на 105 см над полом. К одному или нескольким отверстиям подводится пластиковые туннели, соединенные с коробками, так, чтобы они не были видны с платформы. Вокруг платформы располагаются визуальные метки.

При первом предьявлении платформы животному демонстрируют туннель с коробкой. Насильно запихивать животное в туннель нельзя, т.к. это стрессирует его. Если животное оказывается в ней, действие раздражающего стимула прекращается. Животное остается в коробке 1-2 минуты. После предьявления платформу тщательно моют для удаления запахов. При тестировании животное помещают в центр платформы, замеряется время нахождения туннеля с коробкой и количество ошибок. Если животное не обнаруживает нужное отверстие за 3 минуты, экспериментатор перемещает его к нему на 1 минуту, после чего возвращает в клетку [Barnes, 1979; Sunyer et al., 2007].

Недостатки этого метода:

1. Иногда фактор является недостаточно стрессирующим и животное продолжает исследовать лабиринт, либо садится около нужного туннеля, но не забирается в него. Соответственно, происходит переоценка ошибок [Sunyer et al., 2007; Harrison et al., 2006].
2. Животное может не полагаться на пространственную память, а исследовать отверстия последовательно. Если лабиринт вымыт недостаточно хорошо, оно может руководствоваться обонятельными метками.

Преимущества:

1. Самым главным преимуществом этого лабиринта является то,что он гораздо менее стрессирует животное — неприятные стимулы, предьявляемые животному, являются менее агрессивными, чем в других лабиринтах.
2. Позволяет оценить обучение, рабочую и долговременную память
3. Считается, что он больше подходит для мышей, чем водный лабиринт Морриса.
4. Применяется при оценке экспериментальных моделей расстройств ЦНС — ЧМТ, возрастных изменнеий, болезни Альцгеймера, стресса и т.д. Кроме того, он применяется при фармакологических исследованиях [Paul, Magda, Abel, 2009]⁠.

Object recognition test

Направлен на оценку долговременной памяти животных. Является эффективным способом изучения памяти и внимания многих лабораторных животных. Основан на естественном стремлении животных изучать новые обьекты, то есть, не требует внешней мотивации — награды или наказания. Тест требует относительно мало времени. Дополнительным преимуществом является то, что нет нужды вводить новые вызывающие стресс или отвращение стимулы. Более того, одно и то же животное может быть протестировано в тех же либо изменившихся условиях эксперимента, что снижает количество используемых животных  [Rutten et al., 2008; Silvers et al., 2007].

Во время обучения крысу помещают в белое открытое поле (76х57 см, высота стенки 35 см) в ярко освещенной комнате. При стандартной процедуре как новый, так и уже знакомый животному обьект помещается в 1 из двух позиций, в которой находился ранее знакомый обьект во время обучения. Таким образом различение обьектов основывается на их индивидуальных особенностях и положении. В противном случае, когда оба обьекта помещаются на новые места, распознавание основывается только на их особенностях. Чтобы протестировать влияние положения обьекта на процесс распознавания, в эксперименте используются две копии уже знакомого обьекта. Увеличение доли времени исследования нового обьекта относительно всего времени исследования обьектов крысой рассматривается как показатель усиления когнитивных процессов [Jurado-Berbel et al., 2010; Walf, Rhodes, Frye, 2006].

Обонятельный тест с задержкой (Delayed non-matching to sample with odours)

Отто и Эйгенбаум [Otto, Eichenbaum, 1992]⁠ разработали тест с обонятельными метками. Крысы были обучены и протестированы в квадратном ящике, который содержал обонятельное и водное отверстие. Когда крыса подносила нос хотя бы на 500 мс к обонятельному отверстию, туда подавался 1 из 16 запахов. Если запах отличался от предыдущего, то крыса должна была ткнуть носом в водное отверстие и туда подавалась награда. Если запах не отличался, то тычок в водное отверстие не подкреплялся.

Другой вариант, определявший емкость рабочей памяти крыс, был применен Dudchenko  и др. [Dudchenko, Wood, Eichenbaum, 2000]⁠. Крысам предьявлялся образец песка с добавлением  пряности. Внутри находилось пищевое подкрепление — крыса могла добыть его, разрыв песок. Через некоторое время ей опять предьявлялись две чашечки с песком — одна с уже предьявленным, другая - с новым запахом. Подкрепление находилось только в чашечке с новым запахом.

Крысы выполняли это задание даже когда требовалось запомнить 24 запаха [Dudchenko, 2004]⁠.

Радиальный лабиринт

В классическом виде представляет собой восьмилучевой (хотя это число может отличаться — от 3 до 48 рукавов) лабиринт с центральной площадкой [Magni, Krekulea, Bureša, 1979]⁠. Тест основан на рефлексе избегания больших ярко освещенных пространств(каковым является центральная площадка) и предпочтении узких затемненных укрытий. Широко используется для изучения пространственной памяти. В классическом варианте в каждом рукаве лабиринта располагался кусочек пищи. Соответственно, на центральную площадку запускались голодные крысы. Тест проводился до тех пор, пока животное не находило все кусочки пищи [Paul, Magda, Abel, 2009]⁠. Olton и Samuelson обнаружили у крыс хорошую пространственную память — они избегали заходить в уже посещенные рукава и исследовали преимущественно еще не посещенные [Olton, Samuelson, 1976]⁠. Максимальный обьем рабочей пространственной памяти крыс, по всей видимости, составляет от 24 до 32 мест [Cole, Chappell-Stephenson, 2003]⁠.

Считается, что в решении радиального лабиринта принимают участие два типа памяти: ретроспективная память, содержащая информацию о тех рукавах, которые уже были посещены, и проспективная, которая участвует в последующих выборах. Но результаты, полученные Suzuki и др. [Suzuki, Augerinos, Black, 1980]⁠ в эксперименте, где внешние визуальные метки изменяли свое положение, было показано, что на выбор рукава животным  существенно влияло визуальное окружение.

Кроме того,этот тест имеет свои ограничения:

1)      животное в лабиринте может использовать исследовательскую стратегию вне зависимости от пространственного расположения. То есть крыса может посещать рукава по часовой стрелке или против, что увеличивает вероятность успеха. Использование этой стратегии предотвращается установкой подвижных дверей, запрещающих животному какое-то время выходить из рукава лабиринта, что мешает последовательному посещению рукавов.