Введение новой генетической информации в клетки бактерий

     ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………...……………………………………………….3

ГЛАВА 1. ТЕОРИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР…………………………………..5

1.1. История исследования…………………………………………… …..5

1.2. Введение  новой генетической информации  в клетки бактерий…… ..5

ГЛАВА 2. Методы извлечения плазмидной ДНК…………………..…..10

2.1 Метод  с применением бромистого этидия…………………………..10

2.2Метод  центрифугирования в градиенте  концентрации хлористого

цезия………………………………………………………………………...12

2.3 Щелочной  метод……………………………………………………….13

ГЛАВА 3. Результаты исследований …………………………..………..13

Бактериальная культура……………………………………….…….……15

Выделение плазмидной ДНК……………………………………….…….18

Рестрицирование……………………………………………..…………....22

Электрофореграмма……………………………………………...……….24

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………..……...….………..27

ПРИЛОЖЕНИЕ……………………………………………..……………..28

ЛИТЕРАТУРА………………………………………………….…..……...29 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Введение

     Актуальность. Данная работа посвящена плазмиде, внехромосомному самовоспроизводящимуся генетическому элементу (фактору наследственности) бактерий и некоторых других организмов. Она стабильно наследуется. Представляет собой кольцевую или линейную двухцепочечную молекулу ДНК, закрученную в суперспираль. Использование плазмид, как векторов с вирусными ДНК имеет неоценимое значение для генной инженерии. Является одним из основных ее методов. Громадные потенциальные возможности этой методологии обусловлены не только тем, что с ее помощью можно конструировать и реплицировать рекомбинантную ДНК, но и тем, что она позволяет клонировать отдельные рекомбинантные молекулы ДНК. Таким образом теоретическая и практическая значимость изучения данной проблемы не вызывает сомнения, что и вызвало интерес к ее изучению.

     Цель  исследования. Выделение плазмиды pFF из бактериальной культуры и ее характеристика.

     В соответствии с целью, объектом и  предметом исследования определены следующие задачи:

1. Изучить литературу по проблеме исследования.
2. Выделить плазмиду.
3. Охарактеризовать ее.
4. Сформулировать выводы.

     Объект – клетки Escherichia coli.

     Предмет – плазмидные ДНК.

     Гипотеза. При правильно приготовленных растворах и четко отработанных действиях, выделение и последующие преобразования проходят наиболее успешно.

     Исследование  проводится лабораторным методом. В  ходе работы осуществляется анализ литературы, наблюдение и проверочный качественный эксперимент осуществляемый такими методами как: щелочной метод выделения плазмидных ДНК, методом рестрикции; методом электрофореграммы.

     Структура научно-исследовательской  работы: работа состоит из введения, двух глав, заключения, приложения и использованной литературы.

 

     

     ГЛАВА 1

     ТЕОРИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

     1.1 ИСТОРИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

     Примерно  к 1970 г. стали известны основные свойства генетических систем. Несмотря на отсутствие многих важных деталей, удалось установить принципы репликации, рекомбинации и  репарации и каждый из этих процессов  был воспроизведен in vitro. В этот период выдающихся открытий неожиданной наградой исследователям стала идентификация  многих ферментов, для которых нуклеиновые  кислоты являются субстратом. Получение  их в очищенном виде и определение  свойств в значительной мере облегчило  анализ структуры и функций нуклеиновых  кислот, а применение в дальнейших исследованиях привело к созданию новой области молекулярной биологии - технологии рекомбинантных ДНК.

     Они ведут начало от экспериментов в  сфере бактериальной генетики, и  особенно большую роль здесь сыграла  возможность введения молекул ДНК  в клетки бактерий. Такая введенная  ДНК независимо от того, произошла  ли она из бактериофага или из других бактериальных клеток, изменяет генотип, а нередко и фенотип реципиентной клетки. Гены донорной ДНК способны экспрессироваться и могут рекомбинировать  с хромосомной ДНК.

     1.2 Введение новой  генетической информации  в клетки бактерий

     Бактерии  могут приобретать новый генетический материал несколькими способами. Это:

     1) трансформация, при которой в  клетки проникают молекулы ДНК,  добавленные в культуральную  среду;

     2) конъюгация, в процессе которой  ДНК непосредственно переносится  от одной клетки к другой;

     3)Трансдукция,  опосредуемая бактериофагами, при  которой новая генетическая информация  вводится в клетку с частицей  бактериофага. Независимо от способа  попадания в реципиентную клетку  донорная ДНК рекомбинирует с  гомологичными участками или  специфическими сайтами в геноме  реципиентного организма или  сохраняется в виде автономной  мини-хромосомы, изменяя таким  образом генотип хозяина.

     Трансформация, т.е. изменение генотипа клетки путем  внесения в нее молекул ДНК  из культуральной среды, была первым из способов введения новых генов  в клетки бактерий. Это послужило  также первым доказательством роли ДНК как носителя генетической информации. Если в клетки организма с определенным генетическим нарушением ввести ДНК, выделенную из нормальных клеток, то у этого  организма нередко восстанавливаются  утраченные функции. Такая трансформация  является обычно наследственной и стабильной, поскольку в ее основе лежит рекомбинация между функциональным геном донорной ДНК и дефектным геном реципиента. Однако осуществляемая с помощью  ДНК трансформация оказалась  полезной только при изучении молекулярной генетики прокариот. В других случаях  возможности трансформации ограничивались трудностями выявления трансформирующего  гена, что делало нереальным определение  его структуры. Тем не менее принцип  трансформации нашел применение в другой области. Например, получение  трансформированных клеток является важным этапом во многих экспериментах с  рекомбинантными молекулами ДНК. Термин «трансформация» используется в  молекулярной биологии эукариот для  обозначения стабильного изменения  генотипа и фенотипа клетки.

     При конъюгации осуществляется прямой перенос  ДНК из одной клетки в другую при  их контактировании. В тех случаях, когда конъюгация происходит между  определенными штаммами E. coli, один из них выполняет функции донора, другой - реципиента. Эти эксперименты впервые показали, что все гены Е. coli расположены на одной кольцевой молекуле ДНК. Сравнивая время, необходимое для переноса различных генов во время конъюгации, можно построить генетическую карту хромосомы Е. coli, т.е. установить порядок следования хромосомных генов.

     Охарактеризованы  два типа трансдукции, осуществляемой с помощью бактериофагов, общая  и специфическая. При общей трансдукции  фаговые частицы, содержащие сегменты ДНК клетки-хозяина, переносят относительно протяженные участки геномной ДНК  от одной бактериальной клетки к  другой. Трансдуцирующие фаговые  частицы образуются в ходе определенных инфекционных процессов, когда ДНК  клетки эффективно деградирует и  фрагменты, по размеру примерно соответствующие  фаговому геному, случайно упаковываются  в зрелые частицы бактериофага. В  результате последующего инфицирования  клеток бактерий популяцией фаговых  частиц, содержащей трансдуцирующие  фаги, происходит передача ДНК донорных клеток этим инфицируемым клеткам. Рекомбинация между введенными фрагментами донорной ДНК и ДНК клетки-реципиента приводит к изменению генотипа последней. Каждая трансдуцирующая фаговая  частица обычно содержит только один случайный фрагмент исходной донорной хромосомы. Вероятность включения  в такую частицу любой части  этого генома примерно одинакова. Однако благодаря довольно большому размеру  трансдуци-руемых сегментов ДНК  обычно реципиентная клетка приобретает  за один акт трансдукции целую  группу генов. В результате гены, тесно  сцепленные друг с другом в хромосоме  донора, с высокой частотой котрансдуцируются, тогда как гены, удаленные друг от друга, трансдуцируются независимо. Определение частоты котрансдукции  генов помогает уточнить генетические карты, позволяя оценить относительные  расстояния между тесно сцепленными  генами. 

     Трансдукция второго типа, специфическая, свойственна  бактериофагам, инфекционный цикл которых  прерывается в результате включения  генома вируса в специфический хромосомный  локус ДНК инфицированной клетки. Бактерии, содержащие такие интегрированные  фаговые геномы, получили название лизогенных. Они несут вирусные геномы как наследственные элементы в своих  собственных хромосомах. В лизогенной клетке вирусные и клеточные геномы реплицируются как единое целое  и являются взаимно совместимыми. Интеграция фагового генома с геномом  клетки-хозяина лишает фаг возможности  вызывать гибель клетки и продуцировать  инфекционное потомство. По этой причине  бактериофаг, способный лизогенизировать, в отличие от вирулентного фага получил  название умеренного. При определенных условиях - индукции - лизогенное состояние  прерывается и вирусный геном  вырезается из хромосомы клетки-хозяина. Он реплицируется, образует множество  вирусных частиц и убивает клетку. Обычно вырезание вирусного генома происходит очень точно, и образующийся фаг содержит вирусный геном, полностью  соответствующий исходному. Иногда, однако, фаговый геном вырезается неправильно и в дочерние фаговые  геномы включаются хромосомные гены, прилегавшие к интегрированному вирусному геному. Эти гены включаются вместо некоторых вирусных генов. Во время следующего цикла инфекции гены клетки-донора переходят вместе с фаговыми генами в реципиентные клетки. После включения ДНК трансдуцирующего фага в геном реципиента клетка приобретает  наряду с фаговыми генами генетическую информацию предыдущего хозяина  фага. Таким образом, при специфической  трансдукции фаг служит вектором для переноса генов из одной клетки в другую. С помощью этого механизма  трансдуцируются только те хромосомные  гены клетки-хозяина, которые тесно  сцеплены с сайтом интеграции вирусного  генома.

     Методология получения рекомбинантных ДНК основана на тех же принципах, что и трансдукция.

     Молекулы  ДНК, способные реплицироваться  в соответствующих клетках, представленные вирусными геномами или плазмидами, служат переносчиками, или векторами, «чужеродных» сегментов ДНК, получивших название вставки. При этом, вместо того чтобы полагаться на клеточные  процессы, ведущие к образованию  рекомбинантных трансдуцирующих геномов, проводят объединение, или рекомбинацию, соответствующим образом модифицированных вставок и векторов in vitro с помощью  фермента ДНК-лигазы. Такие рекомбинантные ДНК вводят затем в соответствующие  клетки, где они амплифицируются  в результате репликации.

 

     

     ГЛАВА 2

     РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

     2.1 Метод с применением бромистого этидия

     В присутствии бромистого этидия различие в плавучей плотности плазмидной и хромосомной ДНК становится еще более значительным. Связываясь с линейной двухцепочечной ДНК, этот краситель встраивается между плоскостями  оснований (интеркалирует), вызывает расплетание  двойной спирали, увеличивает длину  линейных фрагментов хромосомной ДНК  и приводит к снижению ее плавучей плотности. В плазмидной ССС-ДНК  интеркаляция красителя вызывает образование  компенсаторных сверхспиральных витков, и при достаточно большом их числе  встраивание следующих молекул  бромистого этидия становится невозможным.

     При равновесном центрифугировании  в градиенте насыщенного раствора хлористого цезия в присутствии  бромистого этидия плазмидная ДНК имеет  более высокую плавучую плотность, чем хромосомная, и концентрируется  в полосе, расположенной ниже, чем  полоса хромосомной ДНК. Обычно эта  полоса имеет красный цвет и ее не нужно визуализировать в УФ-свете. РНК при центрифугировании осаждается на дне пробирки.

     Чтобы отобрать плазмидную ДНК после центрифугирования, пробирку прокалывают сбоку на нужной высоте иглой, надетой на шприц, и  отсасывают материал. Обычно препарат плазмидной ДНК после центрифугирования  в равновесном градиенте плотности  в присутствии красителя содержит очень мало РНК и белков и они  не влияют на последующие манипуляции  с плазмидной ДНК. При необходимости  примеси белков можно удалить  экстракцией фенолом/хлороформом, а  примеси РНК — центрифугированием или хроматографией. Если провести ультрацентрифугирование не удается, то процедуру вьщеления из больших  объемов культуры можно довести до п. 8, а потом до переосаждения этанолом удалить белковые примеси, как это описано в протоколе.