Выведение растений методами генной инженерии, устойчивых к насекомым-вредителям, вирусам и гербицидам

Новосибирский государственный аграрный университет

Кафедра селекции и генетики 
 
 
 

   

РЕФЕРАТ

ТЕМА: Выведение растений методами генной инженерии, устойчивых к насекомым-вредителям, вирусам и гербицидам. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

СОДЕРЖАНИЕ

Введение  в генетическую инженерию………………………………………..3

Методы  генной инженерии…………………………………………………………....3

История генной инженерии…………………………………………………………...4

Основные ферменты: рестриктазы, лигазы, полимеразы………………………………...5

Генная  инженерия растений…………………………………………………...5

Трансформация растительного генома…………………………………………………5

Введение  генов в клетки растений - основные способы…………………………………..7

Экспрессия  генетического материала в трансгенных растениях…………………………8

Введение  ДНК в клетки растений с помощью Ti- и Ri-плазмид………………………….11

Возможности генной инженерии…………………………………………………..…16

Создание  растений, устойчивых к насекомым-вредителям, вирусам и гербицидам………………………………………………………………..……..17

Библиографический список…………………………………………………..22 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение  в генетическую инженерию

Методы  генной инженерии

  Генетическая  инженерия - конструирование in vitro функционально  активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

  Генетическая  инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем  проводимых вне клетки манипуляций  с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций  генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

  Цель  прикладной генетической инженерии  заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию,  диагностировать генетические заболевания,  создавать  ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.

  Технология  рекомбинантных ДНК использует следующие  методы:

• специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
• быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
• конструирование рекомбинантной ДНК;
• гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;
• клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
• введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

История генной инженерии

  Генная  инженерия появилась благодаря  работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

  На  рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к  концу 60-х годов его универсальность  была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

  Историю развития генетической инженерии можно  условно разделить на три этапа.

  Первый  этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

  Второй  этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул  ДНК между хромосомными генами прокариот  и различными плазмидами, доказательством  их стабильности и жизнеспособности.

  Третий  этап - начало работ по включению  в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные  встраиваться в генетический аппарат  клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

  Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

Основные  ферменты: рестриктазы, лигазы, полимеразы

  Генетическая  инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам  генетической энзимологии и химии  нуклеиновых кислот, так как инструментами  молекулярного манипулирования  являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Что же делать? В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.

  Только  они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК  при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

  Следует отметить, что ферменты, применяемые  в генной инженерии, лишены видовой  специфичности, поэтому экспериментатор  может сочетать в единое целое  фрагменты ДНК любого происхождения  в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

  Ферменты, применяемые при конструировании  рекомбинантных ДНК, можно разделить  на несколько групп:

  - ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

  - ферменты, синтезирующие ДНК на  матрице ДНК (полимеразы) или РНК  (обратные транскриптазы);

  - ферменты, соединяющие фрагменты  ДНК (лигазы);

  - ферменты, позволяющие осуществить  изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Генная  инженерия растений

Трансформация растительного генома

  Генетическая  конструкция, вводимая в растительную клетку обычно включает: белок-кодирующую структурную последовательность, сигнальные элементы трансляции и транскрипции, а также маркерные гены.

  Наиболее  важными из регуляторных последовательностей  являются проксимальный участок  промотора, связывающий РНК-полимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый  для связывания с рибосомой и  инициации трансляции, и эукариотический  сигнал полиаденилирования на З'-конце мРНК. Среди эукариотических организмов эти конститутивные сигнальные элементы оказались, к счастью, высококонсервативными и достаточно универсальными, так что растительные клетки в основном правильно экспрессируют чужеродные гены не только растений других видов, но и млекопитающих, дрожжей и других эукариот.

  Однако  для генов бактериального происхождения  необходима замена их конститутивных сигнальных элементов на соответствующие  эукариотические. Помимо этого, для  лучшей экспрессии гена на уровне трансляции мРНК желательно приблизить набор кодонов к типичному для растения. Обычно для этого посредством направленных точечных мутаций заменяют "редкие" кодоны на синонимичные "частые", что не сказывается на первичной структуре белка. В результате экспрессия гена может быть усилена до 300 раз.

  Иногда  в структурной части генов  прокариотического происхождения  могут присутствовать какие-либо нежелательные  сигнальные последовательности, например, узнаваемые на уровне мРНК ферментами сплайсинга или деградации, либо ферментами модификации на уровне белка. Наличие таких скрытых ("криптических") сигналов ведет к резкому снижению экспрессии гена в растении, поэтому их обычно удаляют также путем точечных замен оснований.

  Минимальный промотор, связывающий РНК-полимеразу, как правило, недостаточен для обеспечения заметного, а тем более тканеспецифичного уровня транскрипции. Для усиления экспрессии встроенного гена и придания ей заданных характеристик используют полноразмерные промоторы, включающие энхансеры (усилители) и (или) фактор-зависимые цис-элементы. Это приводит к тому, что подготовленный для трансформации ген, как правило, является химерным, т.е. включает фрагменты ДНК из одного вида, соединенные с фрагментами ДНК из другого вида.

  Набор известных к настоящему дню промоторов достаточно разнообразен и постоянно пополняется. Конститутивные промоторы применяются для наработки существенных количеств продукта гена во всем растении. Для двудольных растений такими эффективными промоторами являются, например, 35S-промотор вируса мозаичности цветной капусты (CaMV) и nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий; для однодольных - промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act).

  Помимо  конститутивных, известно большое число специфических промоторов, которые активны лишь в отдельных органах, тканях или клетках, либо на отдельных стадиях онтогенеза растения. Примером может служить промотор гена пататина картофеля, работающий практически только в клубнях. Имеются также промоторы, активность которых проявляется в листьях, корнях, меристемах и других местах специфической локализации. Интенсивно изучаются и используются также индуцибельные промоторы, которые активируются лишь при определенных условиях: температуры, освещения, концентрации фитогормонов и т.д.

  Многие  из таких промоторов достаточно универсальны, например, некоторые промоторы генов  теплового шока. В частности, промотор гена hsp70 из дрозофилы равно эффективен в клетках растений. Особый интерес  представляют промоторы, индуцируемые низкомолекулярными химическими эффекторами, часто не свойственными растениям. В зависимости от типа промотора, индукторами могут служить тетрациклин, дексаметазон, бензотиадиазол, этанол, ионы меди и другие соединения. Эти промоторы очень важны для фундаментальных исследований трансгенных растений, позволяя четко дифференцировать первичные и вторичные эффекты изучаемого гена и тем самым прояснить его истинную биологическую функцию. Они перспективны также для биотехнологии, так как позволяют вызвать экспрессию гена в заданный период, когда она уже либо не препятствует нормальному росту и развитию растения, либо не вызывает иных отрицательных последствий.