НЕАДАПТИВНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

В иммунном ответе у насекомых участвует множество  разнообразных гуморальных и клеточных факторов. В последних работах появилось подтверждение активного участия рецепторов разных типов (scavenger или SRs, Ig-like и др.), структурно сходных с ГКГ-белками позвоночных, в распознании сигнала «свой-чужой», и значительном внутрипопуляционном полиморфизме этих рецепторов (Lazzaro, 2005). В большинстве работ последних лет, посвященных иммунному ответу у дрозофилы, рассматриваются только механизмы врождённого иммунитета, в частности, различные антимикробные пептиды (AMP). У дрозофилы обнаружено 20 генов AMP, пептидные продукты которых проявляют антимикробную активность. Так, например, дрозомицин и мечниковин действуют как фунгициды; дефенсин препятствует развитию грамположительных бактерий; аттацины, цекропины, диптерицины и дрозоцин обладают антимикробным действием в отношении грамотрицательных бактерий (Irving et al., 2004). Активно изучаются и так называемые «pattern-recognition receptors» - рецепторы, распознающие определенные молекулы, характерные для патогенных микроорганизмов, такие как пептидогликан или липополисахариды - вещества, отсутствующие у эвкариот, но абсолютно необходимые для существования грамотрицательных бактерий.

Такого рода молекулярные защитные механизмы «общего  действия» могут быть вполне эффективными в некоторых случаях, однако в целом очевидно, что их недостаточно для надёжной защиты многоклеточного организма от патогенных микроорганизмов, особенно если учесть коллосальную приспособляемость последних, способность быстро приобретать устойчивость к различным лекарственным препаратам и т.д. (Loker et al., 2004). Более тонкая система адаптации иммунного ответа, связанная со специфическим распознанием чужеродных антигенов и отличением их от «своих», несомненно, существует у беспозвоночных, однако изучена пока слабо. Из имеющихся разрозненных данных, однако, можно заключить, что работа этой системы у разных животных подчинена единым общим принципам.

Важнейшую роль в функционировании иммунной системы у многоклеточных животных играют белки суперсемейства иммуноглобулинов, предшественники которых, по-видимому, появились еще на уровне прокариот, быстро дивергировали, специализировались в ходе эволюции многоклеточных и достигли максимального разнообразия у позвоночных (Галактионов, 1995; Lanz Mendoza, Faye, 1999; Eason et al., 2004). Необходимо отметить, что белки суперсемейства иммуноглобулинов, будучи одним из главных средств различения своего и чужого, у многоклеточных животных выполняют, в том числе, и функции межклеточного взаимодействия (взаимного узнавания, коммуникации) в ходе онтогенеза. Поэтому усложнение организации животных в ходе эволюции шло параллельно с ростом разнообразия иммуноглобулиновых белков. Так, например, у дрозофилы идентифицировано 142 иммуноглобулиновых гена, а у более просто устроенной нематоды Caenorhabditis elegans - только 80, хотя общее число генов у C.elegans больше, чем у дрозофилы (Vogel et al., 2003). Реальное разнообразие иммуноглобулиновых белков у беспозвоночных может быть существенно больше числа соответствующих генов. Это достигается, например, за счет альтернативного сплайсинга, который, по-видимому, осуществляется под контролем сложных регуляторных систем (Celotto, Graveley, 2001).

Иммунологи из Университета Джона Гопкинса (Балтимор, США) обратили внимание на один весьма необычный ген, имеющийся и у позвоночных, и у насекомых. Этот ген называется DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule); определённые его мутации у человека ассоциированы с синдромом Дауна. У насекомых он, как было известно, отвечает за регуляцию роста аксонов (длинных отростков нейронов). Ген этот принадлежит к надсемейству иммуноглобулинов, то есть содержит иммуноглобулиновые домены (определённые последовательности нуклеотидов, кодирующие участки белковой молекулы, предназначенные для избирательного связывания других молекул). Иммуноглобулиновые гены есть практически у всех животных. Они выполняют разнообразные рецепторные функции, далеко не всегда связанные с иммунной защитой. Например, рост аксонов направляется определёнными химическими сигналами, которые тоже кто-то должен улавливать и распознавать.

Как и почти  все гены высших организмов, ген DSCAM состоит из экзонов (кодирующих участков) и вставленных между ними некодирующих интронов. После того, как на матрице гена синтезируется его РНК-копия, интроны из нее вырезаются (этот процесс называется сплайсингом), и уже эта «зрелая матричная РНК» используется как инструкция для синтеза белка. Из одной и той же незрелой РНК иногда может быть сконструировано несколько вариантов зрелой РНК (например, за счет перекомбинирования или выборочного удаления отдельных экзонов). Это явление называется «альтернативным сплайсингом». Благодаря ему один и тот же ген может кодировать несколько разных белков.

Уникальной особенностью гена DSCAM, содержащего 21 экзон, является то, что три из них представлены не в единственном экземпляре, а в виде целых кассет из множества немного различающихся копий: экзон №4 представлен в 14 экземплярах, экзон №6 — в 30, экзон №10 — в 38. В ходе сплайсинга сохраняется только один вариант каждого из этих экзонов. Таким образом, за счёт альтернативного сплайсинга на основе единственного гена DSCAM может быть синтезировано 14 × 30 × 38 = 15960 разных рецепторных белков.

Мысль об участии  гена DSCAM у насекомых не только в нейрогенезе, но и в иммунной защите, по правде сказать, напрашивалась давно, но доказать это удалось только сейчас. Учёные выбрали в качестве объекта исследования малярийного комара Anopheles gambiae (его геном был недавно полностью прочтён), а также культуру «гемоцитоподобных иммунокомпетентных клеток» (то есть клеток иммунной системы) этого комара. Результаты, полученные на целых живых комарах и в культуре клеток почти полностью совпали.

Оказалось, что  в присутствии разных бактерий иммунные клетки производят разные наборы сплайс-вариантов белка DSCAM. Например, в ответ на заражение кишечной палочкой резко увеличивается частота использования 8-го варианта 4-го экзона, тогда как стафилококк стимулирует синтез белков DSCAM с использованием 1-го варианта того же экзона.

Искусственное «выключение» гена DSCAM приводит к резкому снижению способности комара сопротивляться инфекциям; кроме того, в его гемолимфе (аналог крови у насекомых) начинают бурно размножаться бактерии, в норме присутствующие там в небольших количествах. Это доказывает непосредственное участие DSCAM в иммунной защите.

Молекулярные  биологи сегодня умеют «отключать»  не только весь ген целиком, но и выборочно отдельные сплайс-варианты. Для этого в клетки вводят искусственно синтезированные короткие молекулы РНК с последовательностью нуклеотидов, комплементарной определенному экзону. Эти фрагменты слипаются со зрелыми РНК, содержащими данный экзон, что препятствует синтезу белка. Таким образом, было показано, что отключение тех сплайс-вариантов, которые синтезируются в присутствии кишечной палочки, лишает комара способности бороться именно с кишечной палочкой, но не со стафилококком, и наоборот.

Ученым также  удалось показать, что сплайс-варианты DSCAM, синтезируемые в ответ на заражение той или иной бактерией, лучше других «прилипают» именно к этой бактерии.

Изменения в  спектре синтезируемых сплайс-вариантов DSCAM, спровоцированные контактом с бактериями, сохраняются в течение как минимум 18 часов после того, как контакт прекратился (что происходит потом, ученые просто не проверяли). Это отчасти объясняет наблюдаемую у насекомых «иммунную память».

Таким образом, различные сплайс-варианты белка DSCAM до некоторой степени аналогичны антителам позвоночных (хотя антитела значительно более избирательны и эффективны). Образование разнообразных сплайс-вариантов DSCAM осуществляется на основе того же комбинаторного принципа, что и образование антител у позвоночных. В обоих случаях используется случайный выбор и комбинирование отдельных фрагментов гена, каждый из которых представлен в геноме в виде нескольких альтернативных вариантов. Только у позвоночных это «перекраивание» генетической информации осуществляется на уровне ДНК, а у насекомых — на уровне РНК.

За рамками  исследования осталось множество важных вопросов. Например, осталось неясным, каким образом осуществляется регуляция сплайсинга. Откуда комар «знает», какие варианты белка DSCAM нужно синтезировать для борьбы с кишечной палочкой, а какие — для защиты от стафилококка? Теоретически здесь возможны два варианта:

1) Регуляция  без использования обратной связи (какие-то рецепторы распознают класс антигена и дают сигнал синтезировать такой-то набор сплайс-вариантов; в этом случае все ответы известны заранее, они напрямую «записаны» где-то в геноме и являются полностью врождёнными);

2) Регуляция  методом проб и ошибок с использованием обратной связи (синтезируются разные варианты белка, которые затем тестируются на эффективность связывания с антигеном; синтез «удачных» вариантов продолжается, «неудачных» — прекращается; в этом случае можно говорить о настоящем приобретённом иммунитете).

О тесной связи  некоторых молекулярных механизмов регуляции онтогенеза и иммунного ответа свидетельствует также участие сигнального каскада Toll (Toll-signaling pathway) в определении дорзо-вентральной оси у эмбриона дрозофилы и одновременно в иммунном ответе у взрослого насекомого (Leclerc, Reicchart, 2004). Это - еще одно косвенное подтверждение того очевидного факта, что способность к специфическому распознаванию внутренних («своих») химических сигналов является неотъемлемой частью эффективной иммунной защиты.

Другой иммуноглобулиновый белок насекомых - гемолин - предположительно также имеет двойную функцию, участвуя в распознании «чужих» и «своих» антигенов и передаче сигналов как при иммунном ответе (при бактериальной инфекции концентрация этого белка в гемолимфе бабочек возрастает в 20-40 раз), так и в ходе нейрогенеза и других онтогенетических преобразований. Предполагается, что функциональные свойства гемолина могут меняться благодаря конформационным изменениям. В частности, известны различные формы этого белка, одни из которых растворены в гемолимфе, другие связаны с мембраной гемоцитов (Mendoza, Faye, 1999), что замечательно соответствует свойствам иммуноглобулинов позвоночных животных. Пострансляционные конформационные изменения - ещё один потенциальный механизм придания элементов адаптивности «неадаптивному» иммунному ответу у насекомых, наряду с альтернативным сплайсингом. Примечательно, что гемолин - белок, кодируемый одним геном, но приобретающий различные свойства в результате конформационных изменений, способен распознавать как гомофильные, так и гетерофильные сигналы. Первое свойство проявляется в участии этого белка в межклеточных взаимодействиях в ходе онтогенеза, второе - в его способности связывать липополисахариды (компонент клеточной стенки бактерий) и других эффектах, обнаруживающихся в ходе иммунного ответа. Это позволяет рассматривать гемолин и подобные ему белки в качестве возможных предшественников компонентов АИС позвоночных. Предполагается, что специализированные иммуноглобулиновые белки, предназначенные для высоко избирательного связывания «чужих» антигенов, могли развиться из многофункциональных белков - регуляторов межклеточных взаимодействий (Lanz Mendoza, Faye, 1999).

Необходимо иметь  в виду, что иммуноглобулиновые белки отнюдь не являются единственной возможной «материальной основой» адаптивной иммунной системы. Об этом свидетельствуют результаты изучения иммунного ответа у личинок миног. У этих представителей низших позвоночных в адаптивном иммунном ответе ведущую роль играют «вариабельные рецепторы лимфоцитов» (VLR), не относящиеся к иммуноглобулиновому суперсемейству. Соматическая модификация генов VLR имеет место, но типичные для высших беспозвоночных RAG-белки в этом процессе не участвуют (Pancer et al., 2004; Eason et al., 2004). Это в какой-то мере объясняет неудачные поиски биоинформационными методами «следов» АИС в геномах беспозвоночных: возможно, во многих группах животных функции иммуноглобулиновых белков выполняются совсем другими белками.

  АДАПТИВНАЯ ИММУННАЯ СИСТЕМА БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Эксперименты  на губках показали, что у них, по-видимому, существуют довольно сложные механизмы различения «своего» и «чужого», которые отсутствуют на ранних стадиях онтогенеза (у личинок), но имеются у взрослых особей. Личинки губок, даже произошедшие от разных родителей, способны сливаться по нескольку штук в единую химерную личинку, которая нормально метаморфизирует и превращается в жизнеспособную взрослую губку (Fry, 1971; Ilan, Loya, 1990). Фрагменты двух разных особей взрослых губок, вступая в контакт (в эксперименте или, например, в результате шторма) обычно не срастаются (происходит отторжение), тогда как фрагменты, взятые от одной и той же особи, срастаются хорошо (Smith, Hildeman, 1986; Ilan, Loya, 1990). Это означает, что уже у губок, в точности как и у высших многоклеточных, в течение онтогенеза формируется способность отличать свой собственный набор антигенов от чужого, т.е. происходит прижизненная настройка индивидуального набора «распознающих молекул». В результате формируется своего рода иммунологическая модель (образ) самого себя. Развитие способности отличать «своё» от «чужого» в ходе онтогенеза («ювенильная иммунологическая некомпетентность») показано и у других низших многоклеточных, а именно у кораллов (Hidaka, 1985) и гидроидов (Schijfsma, 1939).

Для «иммунологического тестирования» брачных партнеров  вполне достаточно средств неспецифической  иммунной защиты, которые формируются  в ходе онтогенеза и содержат в себе в виде «обратного слепка» информацию о собственных антигенах организма. Однако развитие более сложного механизма специфического иммунитета дает, по-видимому, еще более широкие возможности в этом отношении.

Традиционно считалось, что средства специфической иммунной защиты (возможность вырабатывать специфический иммунитет против новых антигенов в течение жизни и «иммунная память») есть только у позвоночных, однако в последние десятилетия было показано, что многие беспозвоночные (кольчатые черви, членистоногие, иглокожие и др.) тоже обладают такой способностью (Delmotte et al., 1986; Dhainaut, Scaps, 2001; Rheins et al., 1980; Pancer, 2000). Даже у некоторых низших многоклеточных (губок и кишечнополостных) обнаружена способность к выработке приобретенного иммунитета и иммунная память (Hildemann et al., 1980).