Биосинтез нуклеиновых кислот

     Поскольку для образования связей между  нуклеотидами нужна энергия, используются трифосфаты нуклеотидов, содержащих дезоксирибозу, т.е. дезокси-АТФ, дезокси-ГТФ, дезокси-ЦТФ  и дезокси-ТТФ. Эти нуклеотиды содержат по две макроэргические связи, энергии которых с избытком хватает на образование межнуклеотидных связей и на перемещение молекулы ДНК-полимеразы вдоль нити ДНК.

     То, какой нуклеотид будет присоединен, определяется матричной цепью. Против аденина в матрице фермент присоединяет тимин, против тимина – аденин, против гуанина – цитозин, а против цитозина – гуанин. В таком случае фосфат присоединяемого нуклеотида будет находиться рядом с гидроксилом предшествующего, и между ними будет образовываться связь. Если же в ферменте окажется другой, некомплементарный, нуклеотид, фосфат и гидроксил окажутся на достаточно большом расстоянии друг от друга, и связь между ними образоваться не сможет.

     В результате работы ДНК-полимеразы образуется вторая нить ДНК, комплементарная матричной, т.е. образуется двуспиральная молекула, такая же, как и до начала синтеза.

     Однако  такой процесс может идти лишь на одной из двух матричных нитей. Так как фосфат в нуклеотидах  присоединен к 5 положению дезоксирибозы, то вторую связь он должен образовывать с гидроксилом в 3 положении предыдущего нуклеотида, т.е. цепочка ДНК наращивается на 3'-конце. Это значит, что синтез начинается всегда с 5'-конца и идет в направлении к 3'-концу. В двуспиральной ДНК комплементарные нити направлены в противоположные стороны, поэтому по одной из них фермент движется в направлении от 3'-конца к 5'-концу вслед за хеликазой и синтезирует новую нить ДНК от 5'-конца к 3'-концу.

     По  второй матричной нити фермент должен двигаться от 5'-конца к 3'-концу и синтезировать цепочку от 3'-конца к 5'-концу, чего он делать не может. Поэтому синтез на этой нити идет в виде отдельных, относительно коротких фрагментов.

     После того, как хеликаза расплела достаточно протяженный участок, непосредственно  за ней образуется затравка и ДНК-полимераза начинает удлинять ее, двигаясь в направлении, противоположном движению хеликазы. Дойдя до конца однонитевого участка, она заканчивает работу и отделяется от матрицы. За это время хеликаза расплетает новый участок, в конце которого образуется новая затравка и начинается синтез нового фрагмента ДНК.

     Таким образом, по одной матричной нити синтез идет непрерывно, а на второй синтезируются отдельные фрагменты. Затем специальный фермент удаляет РНК-затравки, и ДНК-полимераза застраивает образовавшиеся бреши. Однако она не может соединить между собой фрагменты, синтезированные на второй нити. Для этого в клетках есть фермент, называемый ДНК-лигаза. Она образует связь между последним нуклеотидом одного фрагмента и первым нуклеотидом следующего с использованием энергии АТФ.

     После того, как синтез пройдет вдоль  всей молекулы ДНК-матрицы, образуются две двуспиральные молекулы, идентичные материнской. При этом в каждой молекуле одна из нитей будет старой, входившей в состав материнской ДНК и служившей матрицей при синтезе, а вторая – вновь синтезированной. Механизм синтеза, дающий такой продукт, получил название полуконсервативного.

     Важным  свойством процесса синтеза ДНК является высокая точность. Обычно при репликации совершается не более одной ошибки на 1 млрд присоединенных нуклеотидов. Это значит, что у бактерий, например, один неправильный нуклеотид приходится на тысячу клеток. Понятно, что такая точность позволяет живым организмам сохранять свои генетические свойства в неограниченном ряду поколений.

Однако  некоторое количество ошибок при  репликации ДНК все же происходит. Кроме того, на ДНК в клетке воздействуют различные химические и физические факторы, вызывающие изменение оснований в ДНК или ее разрывы. Это должно приводить к возникновению мутаций или гибели клетки.

     Чтобы предотвратить такие последствия, существует большая группа ферментов, которые узнают участки ДНК, в  которых нарушается принцип комплементарности, т.е. расстояния между цепями ДНК отличаются от обычных или одно из оснований в паре отсутствует. В таких участках разрушается поврежденная нить, и это место застраивается ДНК-полимеразой с образованием правильных пар оснований. Этот процесс называется репарацией ДНК. У некоторых микроорганизмов ферменты репарации работают так активно, что эти микроорганизмы могут жить в воде охлаждающих контуров ядерных реакторов в условиях очень высокой радиации.

       2.2 Транскрипция 

       Транскрипция  – синтез РНК на ДНК, то есть синтез комплементарной нити РНК на молекуле ДНК осуществляется ферментом РНК-полимеразой.

       В процессе транскрипции можно выделить три этапа. Первый этап - инициация  транскрипции – начало синтеза нити РНК, образуется первая связь между  нуклеотидами. Затем идет наращивание нити, ее удлинение – элонгация (второй этап), и, когда синтез завершен, происходит терминация (третий этап), освобождение синтезированной РНК.

       РНК-полимераза при этом «слезает» с ДНК и  готова к новому циклу транскрипции. Бактериальная РНК-полимераза изучена очень подробно. Она состоит из нескольких белковых-субъединиц: двух α-субъединиц (это маленькие субъединицы), β- и β΄-субъединиц (большие субъединицы) и ω-субъединицы. Вместе они образуют так называемый минимальный фермент, или кор-фермент. К этому кор-ферменту может присоединяться σ-субъединица. σ-субъединица необходима для начала синтеза РНК, для инициации транскрипции. После того, как инициация осуществилась, σ-субъединица отсоединяется от комплекса, и дальнейшую работу (элонгацию цепи) ведет кор-фермент. При присоединении к ДНК σ-субъединица распознает участок, на котором должна начинаться транскрипция. Он называется промотор. Промотор – это последовательность нуклеотидов, указывающих на начало синтеза РНК. Без σ-субъединицы кор-фермент промотор распознать не может σ-субъединица вместе с кор-ферментом называется полным ферментом, или холоферментом.

       Связавшись  с ДНК, а именно с промотором, который  распознала σ-субъединица, холофермент  расплетает двунитевую спираль и  начинает синтез РНК. Участок расплетенной ДНК – это точка инициации транскрипции, первый нуклеотид, к которому должен комплементарно быть присоединен рибонуклеотид. Инициируется транскрипция, σ-субъединица уходит, а кор-фермент продолжает элонгацию цепи РНК. Затем происходит терминация, кор-фермент освобождается и становится готов к новому циклу синтеза.

Рисунок 4 – Общая схема транскрипционного цикла 

       РНК наращивается на 3΄-конце. Присоединением каждого нуклеотида кор-фермент делает шаг по ДНК и сдвигается на один нуклеотид. Так как все в мире относительно, то можно сказать, что кор-фермент неподвижен, а сквозь него «протаскивается» ДНК.

       Размер  белкового комплекса, составляющего кор-фермент, 150 Ǻ. Размеры РНК-полимеразы - 150×115×110Ǻ. То есть это такая наномашина. Скорость работы РНК-полимеразы – до 50 нуклеотидов в секунду. Комплекс кор-фермента с ДНК и РНК называется элонгационным комплексом (рисунок 5). В нем находится ДНК-РНК гибрид. То есть это участок, на котором ДНК спарена с РНК, и 3΄-конец РНК открыт для дальнейшего роста. Размер этого гибрида – 9 пар оснований. Расплетенный участок ДНК занимает примерно 12 пар оснований.

Рисунок 5 – Элонгационный комплекс 

       РНК-полимераза связанна с ДНК перед расплетенным участком. Этот участок называется передним дуплексом ДНК, его размер – 10 пар оснований. Полимераза связана  также с более длинной частью ДНК, называемой задним дуплексом ДНК. Размер матричных РНК, которые синтезируют РНК-полимеразы у бактерий, могут достигать 1000 нуклеотидов и больше. В эукариотических клетках размер синтезируемых ДНК может достигать 100000 и даже нескольких миллионов нуклеотидов. Правда, неизвестно, существуют ли они в таких размерах в клетках, или в процессе синтеза они могут успеть процессировать.

       Элонгационный комплекс довольно стабилен, т.к. он должен выполнить большую работу. То есть, сам по себе он с ДНК не «свалится». Он способен перемещаться по ДНК со скоростью до 50 нуклеотидов в  секунду. Этот процесс называется перемещение (или, транслокация). Взаимодействие ДНК с РНК-полимеразой (кор-ферментом) не зависит от последовательности этой ДНК, в отличие от σ-субъединицы. И кор-фермент при прохождении определенных сигналов терминации завершает синтез ДНК.

       Разберем  более подробно молекулярную структуру  кор-фермента. Как было сказано выше, кор-фермент состоит из α- и β-субъединиц. Они соединены так, что образуют как бы «пасть» или «клешню». α-субъединицы  находятся в основании этой «клешни», и выполняют структурную функцию. С ДНК и РНК они, по-видимому, не взаимодействуют. ω-субъединица – небольшой белок, который также выполняет структурную функцию. Основная часть работы приходится на долю β- и β΄-субъединиц. На рисунке β΄-субъединица показана наверху, а β-субъединица - внизу.

       Внутри  «пасти», которая называется главным  каналом, находится активный центр  фермента. Именно здесь происходит соединение нуклеотидов, образование  новой связи при синтезе РНК. Главный канал в РНК-полимеразе – это то место, где во время элонгации находится ДНК. Еще в этой структуре сбоку есть так называемый вторичный канал, по которому подаются нуклеотиды для синтеза РНК.

       Распределение зарядов на поверхности РНК-полимеразы обеспечивает ее функции. Распределение  очень логично. Молекула нуклеиновой кислоты заряжена отрицательно. Поэтому полость главного канала, где должна удерживаться отрицательно заряженная ДНК, выложена положительными зарядами. Поверхность РНК-полимеразы выполнена отрицательно заряженными аминокислотами, чтобы ДНК к ней не прилипала.

       РНК-полимераза работает как молекулярная машина, и в ней есть различные детали, каждая из которых выполняет свою функцию. Например, нависающая над «пастью» часть β΄- субъединицы удерживает передний ДНК-дуплекс. Эта часть называется "заслонкой". После связывания с ДНК заслонка опускается, проходя путь в 30 ангстрем, и зажимает ДНК так, чтобы она не могла выпасть в процессе транскрипции.

       Внутри «пасти» находится активный центр РНК-полимеразы, то есть то место, где непосредственно происходит комплементарное взаимодействие поступившего по боковому каналу рибонуклеоиздтрифосфата с ДНК-матрицей. Если вновь прибывший нуклеотид комплементарен матрице, то он ферментативно пришивается к свободному 3' –концу РНК. По характеру реакция образования новой связи в РНК относится к реакциям нуклеофильного замещения. В ней участвуют два иона магния. Один ион постоянно находится в активном центре, а второй ион магния поступает с нуклеотидом и после образования новой связи между рибонуклеотидами уходит, затем поступает новый нуклеотид со своим новым ионом магния.

       При выходе из РНК-полимеразы ДНК-РНК гибрид должен быть расплетен. В этом участвует структура, называемая «шип».

       В транслокации, то есть перемещении  РНК-полимеразы по нити ДНК, участвует  α-спиральная структура, снизу вверх торчащая из β-субъединицы.

     РНК-полимераза является представителем молекулярных машин. Помимо того, что в начале синтеза ДНК опускается заслонка, меняется конформация других частей РНК-синтазы, в ней во время роста  цепи РНК происходят циклические изменения, не такие сильные, как при начале синтеза цепи. В начале заслонка опускается на 30 Ǻ, а при каждом шаге фермента ДНК протягивается на один нуклеотид. В перемещении по ДНК участвует элемент РНК-полимеразы F-спираль (альфа-спиральная структуры, точащая из бета-субъединицы вверх в главный канал). F-спираль при этом изгибается, перемещается вместе с комплексом РНК-ДНК, освобождается от них и опять выпрямляется. Перемещается F-спираль за один шаг на 3,4 Ǻ. Именно такой шаг у РНК-полимеразы.

       Изменение конформации различных частей РНК-полимеразы происходит за счет изменения потенциальной  энергии, что связано с электростатическими  и гидрофобными взаимодействиями. Если молекулу РНК-синтазы «потрясти» (а  «трясет» ее, также как и все  другие молекулы в клетке, броуновское движение), то она начнет принимать конформацию с более низкой потенциальной энергией. То есть, источником движения молекулярной машины является энергия теплового движения отдельных ее составляющих, а устройство машины таково, что это движение приводит к нужному результату. При этом молекулярная машина потребляет энергию, которая, в основном, идет на изменение состояния тех или иных связей.

     2.3 Трансляция

     Перейдем  к трансляции – синтезу белков. Она проводится рибосомами. Рибосома состоит из двух субчастиц: большой и малой.

     Каждая  субчастица состоит из нескольких десятков белков, каждый из которых уже изучен, известно, каким образом каждый белок  уложен в субчастицу. При исследовании белков используют метод электрофореза, то есть в электрическом поле в специальном геле или специальном носителе молекулы белков разъединяются в зависимости от их заряда и молекулярного веса, то есть под действием поля они начинают двигаться и могут отодвигаться друг от друга на разное расстояние. Другим методом разделения белков является хроматография, в результате этого метода на носителе получают пятнышки, каждый из которых соответствует отдельному белку.

     Белки в рибосоме держатся на каркасе, состоящем  из рибосомной РНК. Формирование рибосомы начинается с того, что рибосомная РНК сворачивается и на нее в определенном порядке начинают налипать белки. На рисунке представлена рибосомная РНК. В ней самокомплементарные участки нити РНК спариваются, образуя шпильки (вторичная структура), и затем РНК сворачивается (третичная структура РНК), образуя каркас субчастиц.