Введение
1 Обзор литературных данных
2 Материал и методика
исследования
3 Результаты и обсуждение
3.1 Цитогенетические исследования
3.1.1 Спонтанный мутагенез
3.1.2 Влияние неравномерного
фракционированного облучения на
прозанник пятнистый (Achyrophorus maculatus
L.)
3.1.2.1 Влияние на индуцированный
мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 5 Гр
3.1.2.2 Влияние на индуцированный
мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 30 Гр
3.1.2.3 Значение временной
организации фракционированного
облучения в формировании радиологического
эффекта
3.2 Биохимические исследования
Заключение
Список использованной
литературы
Приложения
Введение
29 сентября 1957 года вследствие
теплового взрыва емкости с
радиоактивными отходами на Южном
Урале (химкомбинат «Маяк») произошла
одна из наиболее крупных ядерных
аварий. Суммарный выброс радионуклидов
был равен 7,4Ч1016 БкI. Исключительно
важное радиологическое значение
имело присутствие в составе
смеси долгоживущего радионуклида
– 90Sr с периодом полураспада
28,5 лет, что и предопределило
длительную опасность этого радиоактивного
загрязнения [5]. В результате указанного
выброса образовался ВУРСII –
уникальный полигон для изучения
эффектов хронического облучения
малыми дозами [7].
Изучение механизмов
радиорезистентности природных
популяций региона Кыштымской
аварии вносит вклад в разработку
проблемы накопления патологического
груза, механизмов адаптации к
радиационной среде, прогнозирования
отдаленных последствий и поиску
средств их коррекции [16]. Актуальность
этой проблемы определяется тем,
что на ясном понимании закономерностей
формирования биологических эффектов
малых доз ионизирующего излучения
должна основываться разработка
новой концепции радиационной
защиты человека и биоты [8].
В плане выяснения
природы явлений, наблюдающихся
при фракционировании дозы, значительный
интерес представляют работы
с описанием защиты от радиации
под действием предварительного
облучения малой дозой. Радиация
обладает многосторонним действием
на клетку и организм и наложение
двух доз отражается неодинаково
на отдельных составляющих радиационного
эффекта, влияя на выход цитогенетических
нарушений [12].
Целями настоящей работы
на высших растениях с территории
ВУРСа являются:
изучение влияния малых
доз ионизирующих излучений на
спонтанный мутагенез;
межвидовые сравнения
хромосомной нестабильности;
исследование эффекта
неравномерного фракционированного
облучения;
определение роли антиоксидантных
систем в формировании радиопротекторного
эффекта.
Для достижения целей
необходимо выполнение следующих
задач:
ознакомление с объектами
исследования и условиями их
обитания;
анализ состояния проблем
на сегодняшний день;
освоение методик исследований
и применение их на практике;
применение методов
вариационной статистики для
обработки и анализа эмпирических
данных.
1 Обзор литературных данных
Изучение мутационного
процесса в природных популяциях,
подвергающихся хроническому действию
ионизирующих излучений, важно
в связи c задачами, возникающими
в теории эволюции, с разработкой
проблем охраны окружающей среды,
для прогнозирования отдаленных
генетических последствий загрязнения
биосферы радионуклидами [4].
Среди классических
методов радиобиологии и радиационной
генетики наибольший интерес
представляет прием повторного
действия мутагенов. При взаимодействии
эффектов двух доз возможно
модифицирующее влияние предыдущего
облучения на результат последующего.
Фракционирование дозы облучения
является методом анализа процессов
восстановления [12, 25], кроме того, оно неодинаково
отражается на отдельных составляющих
радиационного эффекта. При повторном
облучении в определенных условиях возникает
эффект защиты, который наиболее легко
обнаружить при использовании первого
облучения в небольшой дозе [12]. Считается,
что хроническое облучение является частным
случаем фракционирования дозы [25].
Решающим фактором
в ответной реакции клетки
является доза. Клетка обладает
способностью устранить нанесенное
ей повреждение. Помимо суммарной
дозы на ход реакции восстановления
влияет и мощность доз. Как
правило, при уменьшении мощности
доз, т.е. при растягивании времени
облучения, процесс восстановления
выражен сильнее, а лучевое
поражение меньше [11].
Многие авторы указывают
на повреждающее действие повышенного
фона радиоактивности, однако
положительное действие малых
доз радиации также широко
известно: стимуляция биологических
процессов: роста, развития, выживаемости,
плодовитости, исцеления и др. [12,
21]. В популяциях дикорастущих
растений, произрастающих на загрязненных
радионуклидами территориях, произошли
адаптационные изменения, выражающиеся
в повышенной радиоустойчивости
по сравнению с популяциями
тех же видов, произрастающими
на чистых незагрязненных почвах
[3, 4, 17, 24]. Одним из механизмов
повышения радиоустойчивости облучаемых
организмов является увеличенное
содержание в их тканях антиоксидантов
[17]. Однако мутационный процесс
в облучаемых популяциях растений
протекает более интенсивно по
сравнению с контрольными [4, 24].
Сравнение биохимических
показателей у двух видов мелких
млекопитающих, обитающих на контрольных
и радиационно-загрязненных территориях
ВУРСа позволило отнести характеристики
окислительно-восстановительного метаболизма
к основным физиологическим детерминантами
(определителями) их радиорезистентности
к длительному низкоинтенсивному
воздействию [16].
Приступая к экспериментам
с предварительным облучением
малой дозой, авторы [13] предполагали,
что данное воздействие может
вызвать скрытые лучевые повреждения,
снижающие выживаемость объекта
после дополнительного облучения
массивной дозой, однако их
предположения не подтвердились.
Снижение частоты хромосомных
аберраций при фракционировании
дозы связано с обратимыми
физиологическими изменениями в
клетке, которые делают хромосомы
менее чувствительными ко второй
экспозиции [1]. Авторами [13] высказывается
предположение, что радиобиологические
эффекты радиостимуляции и повышения
радиорезистентности под влиянием
предварительного облучения малыми
дозами регулируются единым механизмом.
В основе радиационно-химических
изменений молекул могут лежать
два механизма. 1. Прямое действие,
при котором данная молекула
испытывает изменение непосредственно
при прохождении через нее
кванта энергии. 2. Косвенное действие
– изменяемая молекула непосредственно
не поглощает энергию падающего
излучения, а получает ее путем
передачи от другой молекулы [9,
25].
Ионизирующие излучения
характеризуются незадержанным
эффектом индуцирования аберраций
хромосом [12], что позволяет использовать
в качестве количественного показателя
радиочувствительности подсчет
клеток с хромосомными перестройками.
Оценка поражения может проводиться
путем мета- или анафазного анализа,
но первый из них весьма
трудоемок. При анализе анафаз
легко различимы «летальные»
для клетки аберрации – дицентрики
и фрагменты; достоинством этого
метода является относительная
простота, делающая его доступным
и в то же время достаточно
корректным для оценки радиочувствительности
[25]. Часть аберраций, как, например,
дицентрики, механически препятствует
делению клетки; появление ацентрических
фрагментов приводит к неравномерному
разделению и утрате генетического
материала, вызывающего гибель
клетки из-за нехватки метаболитов,
синтез которых кодировался ДНК
утраченной части хромосомы [11,
25]. Учет частоты фрагментов, однако,
не является достаточно надежным
показателем вследствие того, что
фрагменты могут вовлекаться
расходящимися хромосомами в
анафазные шапки, где они не
обнаруживаются, после чего элиминируются,
объединяясь в микроядра; к
тому же, фрагменты могут теряться
в процессе приготовления препаратов
[12, 25].
Структурно-метаболическая
теория (СМТ) в радиобиологии является
современным обобщением огромного
фактического материала и ранее
существовавших теорий в радиобиологии
в свете представлений о неразрывном
единстве и взаимовлиянии структуры
и метаболизма. СМТ исходит
из положения, что при действии
радиации на клетку первичные
процессы возникают во всех
ее структурах и затрагивают
многие метаболические процессы,
неразрывно связанные с этими
структурами. Любой радиобиологический
эффект возникает во времени
в результате взаимодействия
многих процессов, как развившихся
после облучения, так и нормально
протекающих в клетке. СМТ подчеркивает
значение фактора времени в
проявлении любых радиобиологических
эффектов. Скорость протекания процессов,
происходящих в клетке после
облучения, будет зависеть не
только от места и величины
поглощенной энергии, наличия
веществ, обрывающих цепные процессы.
Структурно-метаболическая теория
рассматривает механизмы поражающего
действия сублетальных и летальных
доз радиации, так и стимулирующего
действия малых доз радиации.
СМТ является общей теорией
действия радиации на биологические
объекты, начиная с клеточного
уровня и заканчивая высокоорганизованными
многоклеточными организмами [9].
2 Материал и методика
исследования
Объектами исследования
являются многолетние травянистые
растенияIII: Прозанник пятнистый
– Achyrophorus maculatus L. (семейство Сложноцветные;
2n = 10, рис. 1А; стр. I) и два вида
подорожника: Подорожник ланцетолистный
– Plantago lanceolata L. (2n = 12, рис. 1Б) и
Подорожник средний – Plantago media
L. (2n = 24, рис. 1В, оба из семейства
Подорожниковые) [13]. Семена всех
видов растений были собраны
на территории Восточно-Уральского
радиоактивного следа как с
контрольных участков, так и с
загрязнённых радионуклидами 90Sr–90Y
и 137Cs. В местах сбора материала
первоначальное загрязнение составляло
1500-2000 КиIV/км2; 90% дозы формируется
за счёт распада 90Sr и 10% –
за счёт 137Cs. В настоящее время
прошло 1,7 периодов полураспада радиостронция
и остаточное загрязнение составляет
525 Ки/км2 (интенсивность γ-излучения
0,8 рад/сутки) (рис. 2; стр. II) [15].
Реагенты: раствор гидроперита
(0,0025 М), раствор крахмала (0,125% по
массе), раствор йода (0,0125% по массе).
Оценка уровня спонтанного
мутагенеза проводилась на всех
указанных видах, эффекты фракционированного
облучения – на A. maculatus, биохимические
исследования – на двух видах
подорожника.
Семена A. maculatus провокационно
облучались γ-лучами 60Co при мощности
дозы 219 рад/минV. Применялось неравномерное
фракционированное облучение (начальная
доза 5 ГрVI; разрешающая доза 30 Гр) с
интервалами между фракциями
1 час или 1 сутки. Изучались
варианты: без облучения, с облучением
в малой дозе (5 Гр), с облучением
в массивной дозе (30 Гр), а также
варианты с различной временной
организацией облучения (сочетание
5 Гр + 30 Гр).
Исследуемые семена
проращивались, и фиксировались
проростки по достижении длины
корешка в 4-5 мм для прозанника
и 2-3 мм для подорожников в
смеси этанола и «ледяной»
уксусной кислоты в компонентном
отношении 3:1. Учитывались частоты
хромосомных аберраций в ана-телофазе
митоза в клетках корешков, для
чего растения окрашивали ацетокармином
в течение 5-15 минут на водяной
бане. Давленые временные микропрепараты
изготовлялись из кончика корешка
длиной около 2 мм. Наблюдения производили
при 600-кратном увеличении с водной иммерсией,
используя зеленый фильтр. В каждом варианте
просчитывалось в среднем по 500 ана-телофаз.
Микропрепараты фотографировались
по авторской методике без
применения аналогового цифрового
преобразователя при 900-кратном
увеличении с масляной иммерсией
с помощью цифрового фотоаппарата
мобильного телефона LG B2100 (рис. 3; стр.
III, IV).
Биохимические исследования
проводились на P. lanceolata и P. media методом
йодометрии (титрование), в основе
которого лежит реакция [6, 22]: 5H2O2
+ I2 = 4H2O + 2HIO3.
Отобранные для анализа
растения, тщательно очищенные от
земли и обсушенные фильтровальной
бумагой до постоянного веса,
взвешивались и растирались со
стеклянным порошком в фарфоровой
ступке. Полученная смесь разводилась
дистиллированной водой в расчете
9 мл воды на каждые 100 мг растения
и центрифугировалась на ручной
центрифуге в течение 5 минут
при скорости вращения 1200 об/мин.
В раствор гидроперита,
объёмом 5 мл, добавлялись 0,2 мл
надосадочной жидкости, и смесь
выдерживалась в течение 30 секунд,
после чего приливались 3 мл
раствора крахмала в качестве
индикатора. Смесь титровалась йодом
до получения эталонной голубой
окраски, сохраняющейся в течение
3 секунд, после чего регистрировался
объём затраченного йода.
Для статистической
обработки данных использовались
следующие методы: дисперсионный
анализ двухфакторных неравномерных
комплексов для качественных
признаков; дисперсионный анализ
однофакторных комплексов для
качественных признаков; критерий
χІ; точный критерий Фишера (F); критерий
Стьюдента (td); критерий «ФИ» (Fφ).
Для данной обработки в таблицах
Excel автором работы были созданы
алгоритмы вычисления необходимых
показателей с использованием
литературы [14, 23].