Световая микроскопия

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 19 Января 2012 в 14:21, контрольная работа

Краткое описание

Основные задачи микроскопии: выявление возбудителя в клиническом материале, ориентировочная идентификация на основе определения характерных морфологических и тинкториальных признаков микроорганизмов, а также изучение окрашенных мазков из колоний чистых культур. При некоторых инфекционных болезнях, для возбудителей которых характерна специфичность морфологии (про-тозойные болезни, гельминтозы, грибковые заболевания, спирохетозы), микроскопическое исследование — основной или один из основных методов диагностики.

Содержимое работы - 1 файл

Световая микроскопия.docx

— 48.40 Кб (Скачать файл)

     Уход  за микроскопом

     При работе с микроскопом нельзя применять  большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров.

     Чтобы предохранить внутренние поверхности  объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.

     С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы  — это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного  масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.

     Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать  его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой мягкой чистой тряпкой.  
 

     Техника микроскопического  исследования

     Для проведения микроскопического исследования мазки высушивают на воздухе, фиксируют и после этого окрашивают.

     Приготовление мазков

     Исследуемый материал распределяют тонким слоем  по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла.

     Высушивание и фиксирование мазков

     Приготовленный  на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного  высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности  предметного стекла, и поэтому  при последующей окраске препарата  микробные клетки не смываются. Кроме  того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

     Ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска  выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры.

     Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой  температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

     - Физический способ фиксации

     Предметное  стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра  мазком кверху и плавным движением  проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2с. Надежность фиксации проверяют следующим приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

     - Химический способ фиксации

     Для фиксации мазков применяют также  химические вещества и соединения - этиловый (винный) спирт 960, ацетон, смесь  Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (спирта 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, ледяной уксусной кислоты 10 мл).

     Предпочтительнее  считается щадящая химическая фиксация (ацетон, смесь Никифорова, жидкость Карнуа) [15].

     Предметное  стекло с высушенным мазком погружают  в склянку с фиксирующим веществом  на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

     Далее проводится классическая окраска мазка  по методу Грама. Для проведения этой окраски могут быть использованы специальные комерческие красители, например, фирмы BioMerioux или красители, приготовленные непосредственно в лаборатории.

     Окраска по Граму

     Окраска по Граму относится к сложному способу окраски. При сложных  способах окраски на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой – дополнительным. Кроме красящих веществ, при сложных  способах окраски применяют различные  обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты  и т.д.

     Особенностью  окраски по Граму является неодинаковое отношение различных микроорганизмов  к красителям трифенилметановой  группы: генциановому, метиловому или  кристаллическому фиолетовому. Микроорганизмы, входящие в группу грамположительных (Грам+), например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам(+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Грам-) микроорганизмы (бактероиды, фузобактерии и др.) образуют с генциановым кристаллическим или метиленовым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

     Отношение микроорганизмов к окрашиванию  по Граму имеет большое диагностическое  значение.

     Приготовление растворов

     Кристаллический фиолетовый (фуксин Циля карболовый) –  карболовый раствор: 1г кристаллического метилового фиолетового растирают в фарфоровой ступке с 5г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 мл спирта. После того как краситель хорошо разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор красителя фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой.

     Раствор Люголя – 2г йодида калия растворяют в 5-10 мл дистиллированной воды, затем  прибавляют 1г кристаллического йода, оставляют на несколько часов  до полного его растворения и  после этого приливают приливают 295-290 мл дистиллированной воды.

     Фуксин  спирто-водный (раствор Пфейфера) –  к 1 части карболового фуксина  Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень не стойкий, поэтому  его готовят в небольших количествах  непосредственно перед употреблением.

     Методика окраски

  1. Фиксированный мазок окрашивают через фильтровальную бумагу основным красителем – раствором основного карболового кристаллического фиолетового. Прокрашивание длится 1-2 минуты.
  2. Снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.
  3. Раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стаканчик со спитртом, процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.
  4. Препарат тщательно промывают водопроводной водой.
  5. Докрашивают спирто-водным раствором фуксина.
 

     Прокрашивание длится 1-2 минуты.

     Результаты окраски

     Грам(+) микроорганизмы окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, Грам(-), воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый  цвет.

     К недостаткам этого метода окраски  по Граму следует отнести определенные трудности при отнесении выявленных микроорганизмов к Гр(+) или Гр(-) по цвету из-за их неоднородного прокрашивания. Это возможно в результате присутствия в мазке большого количества слизи и разнообразных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.  
 

Информация о работе Световая микроскопия