Аминокислоты

      В лабораторних умовах швидкість хімічних реакцій зазвичай підвищують нагріванням (ми це неодноразово застосовували під час виконання значної частини дослідів, що наведені в книзі). Завдяки біологічним каталізаторам – ферментам – хімічні реакції в клітині (або за її межами, якщо фермент поступає в міжклітинний простір) проходять з великою швидкістю та при відносно низький температурі. За висловом біохіміків, «за відсутності ферментів реакції проходили б настільки повільно, що їх результати навряд чи б мали значення».

     Назви ферментів зазвичай мають закінчення –аза, але є й винятки, наприклад: пепсин, трипсин та інші. Часто назва ферменту походить від назви тієї речовини (субстрату), на який він чинить каталітичну дію, від кінцевих продуктів перетворення або від типу зв’язків, що руйнуються під дією ферменту. Наприклад: уреаза діє на сечовину (від лат. urea – сечовина), інвертаза каталізує гідроліз сахарози (утворюється інвертний цукор), фосфорилази руйнують естерні зв’язки, відщеплюючи фосфатну кислоту.

     Історія вивчення ферментів починається  з 1850 року, коли Луї Пастер вивчаючи ферментацію дійшов висновку, що для перетворення цукру в етиловий спирт і СО₂ необхідні живі клітини дріжджів (Saccharomyces cerevisiae). Пастер дослідив, що нагрівання ферментної суміші призводить до припинення спиртового бродіння, тому що клітини при цьому гинуть. Німецький вчений Бюхнер довів, що присутність живих клітин не обов'язкова. Бюхнер зруйнував клітинні оболонки, розтираючи дріжджові клітини з кварцовим піском. З дріжджової маси було віджато «сік», який не містив клітин, але мав здатність зброджувати виноградний цукор до етилового спирту і карбону (ІV) оксиду. Було зроблено висновок, що нагрівання клітин призводило до денатурації активної речовини клітин і перетворювало її на неактивну. При обробці дріжджів по методу Бюхнера, активна речовина залишалася незмінною.  

Дослід 10.3.10 Каталізатори в рослинних клітинах 

      гідрохінон

     3 % розчин перекису  водню Н₂О₂

     свіжі овочі 

     Для дослідів необхідно приготувати  витяжки з рослинних тканин: капусти, бульб картоплі і етиольованих паростків (ростків, що були вирощені за відсутності світла), м'ясистої луски цибулини і зеленої цибулі і інших овочів і фруктів. Рослинний матеріал (кожна рослина або його частина - окремо від інших) дрібно нарізається і розтирається товкачем в ступці з додаванням 2-3 мл дистильованої води на кожні 1-2 г рослинного матеріалу. Кашки, які вийдуть, переносять на марлю, складену в 2-4 шари і віджимають сік в склянки. Також можна кашки перенести в колби, долити по 80-100 мл води і залишити суміш стояти на 30 хвилин – 1 годину, а потім відфільтрувати її через паперовий фільтр.

     Отриманий фільтрат розбавляється водою в 2-3 рази (у випадку капусти розбавлення  може бути більшим). 

А. Виявлення ферментів  – каталізаторів  

     В пробірку з водою додайте на кінчику  ножа гідрохінон. Розчин розділіть на дві рівні порції. В одну додайте 5-6 крапель перекису водню, в іншу - стільки ж крапель води. Вміст перемішайте. Через декілька хвилин з'являється рожеве забарвлення, особливо яскраве в пробірці з перекисом водню, оскільки гідрохінон окислюється перекисом водню.

     Розлийте  в дві пробірки по 2 мл приготовані рослинні соки.

     В першу пробірку до соку додайте трохи (на кінчику шпателя) гідрохінону і знову розділіть вміст на дві рівні порції. Позначте ці пробірки, наприклад, 1А і 1Б. В одну з них (1Б) додайте 5 крапель перекису водню. Це потрібно зробити швидко і одразу ж вміст пробірок прокип'ятити.

     В іншу пробірку до 2 мл свіжого соку додайте гідрохінону. Вміст розлийте на дві порції та позначте пробірки 2А та 2Б. До пробірки 2Б додайте 5 крапель перекису водню.

     Всі чотири пробірки слід виставити для  огляду.

     В результаті досліду будуть виявлені ферменти, що прискорюють процес окислення гідрохінону (пробірка 2Б). Також буде підтверджено, що ферменти при кип'яченні втрачають свої властивості (пробірки 1Б і 1А). Денатурація білків вже знайома нам по дослідах 10.3.1, 10.3.2 та 6.2.2. 

Б. Дослідження вмісту ферментів в різних частинах рослин 

      Досліди проводять паралельно: наприклад, бульба картоплі і її паросток, зелені пера цибулі і донці цибулини. Результати дослідів можна записати у вигляді таблиці і зробити висновок, в яких частинах рослин обмін речовин йде інтенсивніше, тобто де міститься більше ферментів.

     Такі  серії дослідів можна продовжити для визначення оптимальних температур, при яких діють ферменти: з використанням льоду або охолоджувальної суміші, а також водяної бані з різною температурою. Для визначення оптимальної кислотності середовища: з використанням розчинів кислот, лугів і індикаторного паперу. Можна також змінити досліджувані тканини і використати молоко, дріжджі або м'язову тканину тварин, що викличе інтерес дослідників. 

     Втрата  активності ферментів може відбуватися  також за присутності деяких хімічних речовин – інгібіторів. Дуже часто  інгібіторами є токсини, які пригнічують  дію певних ферментів.  

Дослід 10.3.11 Гальмуюча дія іонів хлору на окислювальні ферменти яблука 

      два яблука

      хлорид  натрію NaCl

      хлорид  калію KCl

      йодид натрію

      бертолетова сіль KClO₂ або хлороформ CHCl₃ 

      Добре відомо, що зрізи яблука під дією окислювальних ферментів дуже швидко темніють на повітрі. Дія цих ферментів може бути загальмована деякими речовинами, зокрема іонами хлору.

      В досліді доцільно застосувати не тільки хлорид натрію NaCl (або калію KCl), але й йодид натрію NaI, і  бертолетову сіль KClO₂. NaI застосовується для доведення того, що діючим елементом у хлориді натрію є іон хлору, а ні іон натрію. Застосування бертолетової солі засвідчує, що хлор виявляю гальмуючу дію тільки у вигляді іону. Замість бертолетової солі можна використати хлороформ CHCl₃.

      На  занятті два яблука розрізаються навпіл. Першу половинку залишають для контролю, другу посипають NaCl, третю – NaI, четверту – бертолетовою сіллю (або злегка змочують хлороформом). Всі чотири половинки залишають на повітрі протягом 15-20 хвилин. За цей час зрізи трьох половинок – 1-ї, 3-ї і 4-ї темніють, а зріз 2-ї половинки залишається без змін.

      Таким чином, дослід показує, що іон хлору  є інгібітором деяких окислювальних  ферментів яблука. 

     Дія ферментів є вибірковою. Деякі  ферменти є абсолютно специфічними. Наприклад, уреаза каталізує тільки гідроліз сечовини (дивись дослід 8.2.3). Інші ферменти є активними тільки по відношенню до певних хімічних зв’язків: пепсин, наприклад, каталізує гідроліз пептидних зв’язків, в створенні яких беруть участь ароматичні амінокислоти. Якщо амінокислота, що утворює пептидний зв’язок, містить вільну аміногрупу, цей пептидний зв’язок пепсин не гідролізує:

            Х-зв’язок може бути гідролізовано пепсином

            Z-зв’язок не піддається гідролізу

     В результаті гідролізу молекули білку розщеплюються на поліпептиди різної маси.

     В деяких випадках ферменти стають активними  тільки під дією активатору: наприклад, хлоридна кислота HCl активує пепсиноген, перетворюючи його на пепсин. При цьому  ця речовина повинна мати оптимальну концентрацію. Ферменти дуже чутливі до дії лугів та кислот, тому їх дія залежить від рН середовища. Як було зазначено, багато ферментів піддаються денатурації та втрачають активність при нагріванні вище 60°С.

      Сама  хлоридна кислота теж може гідролізувати  пептидні зв’язки незалежно від природи амінокислот, що утворюють зв’язок, але такий гідроліз триває значно повільніше, ніж під дією пепсину. 

Дослід 10.3.12 «Штучний шлунок»³ 

      водний  розчин пепсину⁴

      зварене в круту яйце

      концентрована хлорида кислота НCl 

      Дрібно  нарізати зварений в круту (кип’ятити 10 хвилин) білок курячого яйця і змішати  його в хімічній склянці з 100 мл води, 0,5 мл концентрованої хлоридної кислоти  НCl і 50 мл розчину пепсину.

      Хлоридну  кислоту треба додати тому, що пепсин діє тільки і кислому середовищі (діапазон рН від 1,4 до 2)⁵.

      Склянку утримують кілька годин при температурі  близько 40°С. Протягом перших 15 хвилин кожного часу вміст склянки перемішують скляною паличкою (Увага! Дослід супроводжується кислим запахом неповністю перетравленої їжі).

      Вже через 2 години ми помітимо, що кількість  білка істотно зменшилася. Через 4-8 годин весь білок розчиниться  і утвориться невелика кількість  білих зі слабким жовтуватим відтінком  лусочок. При цьому яєчний білок, що має складну структуру, гідролізується та перетворюється на суміш сполук більш простої будови – пептидів.