Физико-химические свойства белков и методы их определения

 
       Введение

       Белки -  высокомолекулярные азотистые органические вещества, построенные из аминокислот и играющие фундаментальную роль в структуре и жизнедеятельности организмов. Белки - основная и необходимая составная часть всех организмов. Именно Белки осуществляют обмен веществ и энергетические превращения, неразрывно связанные с активными биологическими функциями. Сухое вещество большинства органов и тканей человека и животных, а также большая часть микроорганизмов состоят главным образом из белков (40-50%), причем растительному миру свойственно отклонение от этой средней величины в сторону понижения, а животному - повышения. Микроорганизмы обычно богаче белком (некоторые же вирусы являются почти чистыми белками). Таким образом, в среднем можно принять, что 10% биомассы на Земле представлено белком, то есть его количество измеряется величиной порядка 10¹² - 10¹³ тонн. Белковые вещества лежат в основе важнейших процессов жизнедеятельности. Так, например, процессы обмена веществ ( пищеварение, дыхание, выделение, и другие) обеспечиваются деятельностью ферментов , являющихся по своей природе белками. К белкам относятся и сократительные структуры, лежащие в основе движения, например сократительный белок мышц ( актомиозин), опорные ткани организма (коллаген костей, хрящей, сухожилий), покровы организма ( кожа, волосы, ногти и т.п.) , состоящие главным образом из коллагенов, эластинов, кератинов, а также токсины, антигены и антитела, многие гормоны и другие биологически важные вещества.

       Роль  белков в живом организме подчеркивается уже самим их названием «протеины» (в переводе с греческого protos - первый, первичный), предложенным в 1840 г. голландским химиком Г. Мульдером, который обнаружил, что в тканях животных и растений содержатся вещества, напоминающие по своим свойствам яичный белок. Постепенно было установлено, что белки представляют собой обширный класс разнообразных веществ, построенных по одинаковому плану. Отмечая первостепенное значение белков для процессов жизнедеятельности, Энгельс определил, что жизнь есть способ существования белковых тел, заключающийся в постоянном самообновлении химических составных частей этих тел.

       В природе существует примерно 10¹⁰-10¹² различных белков, обеспечивающих жизнедеятельность организмов всех степеней сложности от вирусов до человека, они обеспечивают жизнь более 2 млн. видам организмов. Белками являются ферменты, антитела, многие гормоны и другие биологические активные вещества. Необходимость постоянного обновления белков лежит в основе обмена веществ. Именно поэтому белки и явились тем исключительным материалом, который послужил основой возникновения жизни на Земле. Ни одно вещество из всех веществ биологического происхождения не имеет столь большого значения и не обладает столь многогранными функциями в жизни организма как белки.

       Ф. Энгельс писал: «Повсюду, где мы встречаем жизнь, мы находим, что она связана с каким-либо белковым телом и повсюду, где мы встречаем какое-либо белковое тело, которое не находится в процессе разложения, мы без исключения встречаем и явления жизни».

       1 Роль индивидуальных  белков в биохимических  исследованиях

       Важное  место в биохимических исследованиях  занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные  индивидуальные белки нужны для  изучения их первичной структуры, получения  кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом  рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией.

       Некоторые очищенные индивидуальные белки  используют в медицине как лекарственные  препараты, например гормон инсулин  применяют для лечения сахарного  диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают  при нарушении её функций в  качестве заместительной терапии. Кроме  того, очищенные ферменты часто используют в биохимических исследованиях  в качестве химических реактивов  для определения веществ в  биологических жидкостях.

       Большинство методов, используемых для очистки  индивидуальных белков, основано на различиях  их физико-химических свойств, а также  возможности специфично связываться  с лигандом.

       2 Физико-химические свойства белков

       Индивидуальные  белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

1. Различия белков по форме молекул

       Как уже говорилось выше, по форме молекул  белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).

2. Различия белков по молекулярной массе

       Белки - высокомолекулярные соединения, но могут  сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).

3. Суммарный заряд белков

       Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис.

       Степень ионизации функциональных групп  этих радикалов зависит от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО^- + Н⁺ → -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН^- с протонами, образующимися при диссоциации NH₃⁺ с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков:

-NH₃⁺ +ОН^- → -NH₂ + H₂O.

       Значение  рН при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют «изоэлектрическая точка» и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.

       Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО^-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина.

       Белки, имеющие суммарный положительный  или отрицательный заряд, лучше  растворимы, чем белки, находящиеся  в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду (-). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле.

4. Соотношение полярных и неполярных групп на поверхности нативных молекул белков

       На  поверхности большинства внутриклеточных  белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных белков. Так, протомеры олигомерных белков в области контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также обогащены гидрофобными радикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.

5. Растворимость белков

       Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных  выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения  полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме  этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в  растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче  растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С  другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать вьшадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.

       3 Методы выделения и очистки белков

       Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных  культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

•       дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;
•       фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;
•       экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
•       разделение смеси белков на индивидуальные белки.

3.1 Методы разрушения тканей и экстракции белков

       Для разрушения биологического материала  используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания  и оттаивания, а также обработку  клеток ультразвуком.

       Гомогенизация биологического материала

       Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

         Метод замораживания и оттаивания ткани

       В результате попеременного замораживания  и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

       После разрушения ткани нерастворимые  части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование  гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

       Экстракция  белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры

       Если  искомый белок прочно связан с  какими-либо структурами клетки, его  необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных  взаимодействий между белками и  липидами мембран в раствор добавляют  детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.

       При действии детергентов обычно разрушаются  и гидрофобные взаимодействия между  протомерами в олигомерных белках.

       Удаление  из раствора небелковых веществ

       Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются  из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию  некоторых белков. Нуклеиновые кислоты  осаждают добавлением в раствор  стрептомицина.

       3.2 Методы очистки белков

       Наиболее  трудоёмкий этап получения индивидуальных белков - их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый  белок присутствует в небольших  количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.

       Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах.

       На первых стадиях  очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную  особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.