Физико-химические свойства белков и методы их определения

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 19 Октября 2011 в 19:17, реферат

Краткое описание

Белки - высокомолекулярные азотистые органические вещества, построенные из аминокислот и играющие фундаментальную роль в структуре и жизнедеятельности организмов. Белки - основная и необходимая составная часть всех организмов.

Содержимое работы - 1 файл

Физико.docx

— 115.24 Кб (Скачать файл)

       Очистка белков избирательной денатурацией

       Большинство белков денатурирует и выпадает в  осадок уже при кратковременном  нагревании раствора до 50-70°С или подкислении раствора до рН = 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок-белки, или осадить их центрифугированием.

       Высаливание

       Метод очистки белков, основанный на различиях  в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

       Чаще  всего для разделения белков методом  высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

       Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

       Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

       Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".

       Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую  способны проникать низкомолекулярные  вещества и белки с небольшой  молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

       Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул (рисунок 1).

       

Рисунок 1 - Разделение смеси белков методом гель-фильтрации

       Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.

       Ультрацентрифугирование

       Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой (рисунок 2). После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

Рисунок 2 - Кювета, заполненная буферным раствором с разделёнными белковыми фракциями

       Электрофорез  белков

       Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

       Электрофорез  проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза  на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

       Разрешающая способность электрофореза в  полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, αглобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рисунок 3). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

       

Рисунок 3 - Электрофорез белков сыворотки крови  здорового человека на бумаге.

       Ионообменная  хроматография

       Так же как и электрофорез, метод основан  на разделении белков, различающихся  суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

       В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

       Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

       Выбор ионообменника определяется зарядом  выделяемого белка. Так, для выделения  отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

       Аффинная  хроматография, или хроматография  по сродству

       Это наиболее специфичный метод выделения  индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рисунок 4). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

       

Рисунок 4 - Аффинная хроматография

       Аффинная  хроматография отличается высокой  избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

    1. Очистка белков от низкомолекулярных примесей

       Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония  после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.

       Скорость  выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту  его концентраций по обе стороны  от мембраны. По мере выхода соли из мешочка  буферный раствор в стакане меняют.

       Для очистки белков от низкомолекулярных  примесей используют также метод гель-фильтрации.

       Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

       Заключение

       В данной работе при помощи различных схем и рисунков были рассмотрены физико-химические свойства белков (молекулярная масса, форма молекул и т.д.), методы их очистки и выделения, а также роль индивидуальных белков в белков  в бохимических исследованиях.

       Доказано, что белки - обязательная составная  часть всех живых клеток, играют исключительно важную роль в живой  природе, являются главным, наиболее ценным и незаменимым компонентом питания. Это связанно с той огромной ролью, которую они играют в процессах  развития и жизни человека. Белки  являются основой структурных элементов  и тканей, поддерживают обмен веществ  и энергии, участвуют в процессах  роста и размножения, обеспечивают механизмы движений, развитие иммунных реакций, необходимы для функционирования всех органов и систем организма.

       «Жизнь - это форма существования белка» 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

       Список  использованных источников

       1Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

       2. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. - М.: ИзD-во «Ангар», 1999. - 512 с.

       3. Жеребцов Н.А., Попова Т.Н., Артюхов  В.Г. Биохимия – Воронеж: Издательство ВГУ, 2002. - 696 с.

       4. Биохимия растительного сырья. /Под. ред. В.Г. Щербакова. - М.: Колос, 1999. - 376 с.

       5. Ленинджер А. Биохимия. - М.: Мир, 1999 Т 1-3.

       6. Основы биохимии / Под ред. А.А. Анисимова. - М.: Высшая школа, 1986. - 551 с.

       7. Кретович В.Л. Биохимия растений М.: Высш. школа, 1986, - 503 с.

       8. Химия и биохимия аминокислот  и полипептидов. Методические указания  для студентов технологических  специальностей по дисциплинам  «Органическая химия», «Биологческая химия» и «Химия природных волокнообразующих полимеров». МГУП, Могилев, 2003. - 43 с. 

Информация о работе Физико-химические свойства белков и методы их определения