Автор работы: Пользователь скрыл имя, 29 Ноября 2011 в 18:34, реферат
Инсулин, белковый гормон, вырабатываемый поджелудочной железой и регулирующий уровень сахара (глюкозы) в крови; препараты инсулина применяются для лечения сахарного диабета. Гормон синтезируется в бета-клетках, которые входят в отдельные гормон-секретирующие группы клеток поджелудочной железы, называемые островками Лангерганса. Слово «инсулин» (от лат. insula – остров) указывает на «островковое» происхождение гормона.
Инсулин был впервые выделен из поджелудочной железы в Канаде в 1921 Ф.Бантингом и Ч.Бестом, сотрудниками Дж. Маклеода. Признанием их работы явилась Нобелевская премия по физиологии и медицине, присужденная Бантингу и Маклеоду в 1923.
Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).
При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:
-
белок носитель, обеспечивающий
транспортировку гибридного
-
аффинный компонент,
При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.
В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.
Химическим
способом получают ген, программирующий
биосинтез предшественника
Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или гены цепей порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия.
Из E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью в-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.
Природа гормонального вещества, продуцируемого E.coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препитида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин.
Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химко-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фпрнтальной, гельпроникающей, анионообменной).
В
Институте РАН получен
Можно использовать штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.
Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.
Возможен и другой путь: получается в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.
Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.
В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида.
Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды соединяются по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.
Секреция инсулина
Секреция инсулина контролируется изменениями концентраций циркулирующих в крови нутриентов (глюкозы, аминокислот, жирных кислот), гормонами желудочно-кишечного тракта, секретируемыми в нервно-гуморальную фазу сокоотделения (например, ГИП, гастрин, секретин) и различными нейромедиаторами (помимо классического ацетилхолина можно назвать такие пептидные медиаторы, как ВИП и холецистокинин). Перечисленные гормоны и медиаторы обуславливают так называемые энтероинсулярные стимулы секреции инсулина. Следует отметить, что их значение второстепенно; т. е. главными стимулами служат "пищевые" стимулы. По мере того, как концентрация, например, глюкозы в крови увеличивается [обычно достигая уровня 6-9 ммоль/л (норма: 5 ммоль/л)], стимулируется секреция инсулина, и этот эффект усиливается гормонами желудочно-кишечного тракта.
Показано, что эффекты нутриентов на секреторную активность b -клеток поджелудочной железы являются результатом их прямого взаимодействия с клеточными мембранами железистых клеток. Глюкоза и другие подвергающиеся метаболизму питательные вещества (включая некоторые аминокислоты и жирные кислоты) транспортируются в b -клетки островков Лангерганса, где в процессе их метаболизма образуется АТФ. Считается, что продукция АТФ обеспечивает стимул для начала секреции инсулина изменением мембранного потенциала, в конечном итоге обеспечивающим поток ионов Са 2+ в цитоплазму.
В состоянии
покоя мембранный потенциал (ПП) на
внутренней поверхности мембраны равен
-50-70мВ. Как известно, изменения ПП
в большей степени
Образовавшийся АТФ вызывает закрытие АТФ-чувствительных калиевых каналов. Это предотвращает выход К + из клетки, что является результатом накопления в ней положительных зарядов и, соответственно, деполяризации мембраны. По достижении порога (снижение потенциала на 15 мВ) открываются потенциал-чувствительные Са каналы, обеспечивая поток ионов Са 2+ в клетки. Са-чувствительные калиевые каналы открываются по мере того, как Са 2+ поступает в клетку, благодаря чему К + выходит из нее, восстанавливая ПП.
Ионы Са 2+ обеспечивают секрецию инсулина из секреторных гранул несколькими путями:
1) Положительно заряженные ионы Са 2+ облегчают экзоцитоз (инсулин секретируется из клеток именно таким путем), уменьшая электростатическое отталкивание между отрицательно заряженными поверхностями плазматической мембраны и мембран секреторных гранул.
2) Са 2+ облегчает передвижение гранул внутри клеток, т. к. влияет на функцию сократительных белков, содержащих актин и тубулин (микротрубочек и микрофиламентов).
3) Са 2+ связывается с калмодулином; это активирует фермент аденилатциклазу, катализирующую превращение АТФ в цАМФ. Этот вторичный посредник также образуется в результате прямой активации АЦ гормонами желудочно-кишечного тракта. Циклический АМФ потенциирует секрецию инсулина путем увеличения чувствительности b -клеток к стимулирующему действию кальция. О клеточных процессах, лежащих в основе увеличения чувствительности b -клеток к Са 2+ , известно мало. Предполагается, что активируются ферменты (такие как протеинкиназы), влияющие на функционирование митротрубочек и микрофиламентов.
4) Чувствительность b -клеток к Са 2+ увеличивается и другими вторичными мессенджерами (инозитолтрифосфатом и диацилглицеролом) предположительно таким же путем. Эти вторичные посредники образуются при взаимодействии нейромедиаторов энтероинсулярной оси (асh, холецистокинин) с фосфолипазой С, встроенной в плазматическую мембрану.
Еще раз следует подчеркнуть, что вышеперечисленные вторичные мессенджеры служат для увеличения секреции инсулина; тогда как главным стимулом служит увеличение концентрации глюкозы.
Действие инсулина на клетки
После секреции инсулина в межклеточное пространство он проходит через эндотелиальный барьер и попадает в кровь. Недавно стал известен механизм захвата глюкозы клетками. В этих клетках имеются небольшие везикулы, содержащие специфические белковые макромолекулы, которые называются транспортерами глюкозы. Инсулин стимулирует сплавление мембран везикул с плазматической мембраной и активирует транспортеры глюкозы, которые переносят глюкозу в клетку. Инсулин отвечает за синтез фермента гексокиназы, который фосфорилирует глюкозу, как только она проникает в клетку. Эффекты гормона на клеточном уровне достигаются путем активации или, наоборот, торможения активности ферментов или же изменением скорости синтеза ферментов на уровне транскрипции и трансляции.
Путь трансмембранного проведения гормонального сигнала - тирозинкиназный. Инициация действия инсулина обуславливается взаимодействием гормон-рецептор. Рецепторы инсулина относятся к семейству гетеротетрамерных рецепторов тирозинкиназы. Они образованы двумя парами a и b субъединиц, скрепленными дисульфидными мостиками. Две a субъединицы формируют один связывающий центр для лиганда. Образование Г-Р комплекса обуславливает аутофосфорилирование ферментов, "вмонтированных" в b субъединицы, по остаткам тирозина; в результате чего повышается ферментативная (тирозинкиназная) активность рецептора. Сигнал передается дальше посредством каскадных реакций:
1) Каскад ферментов (киназ и фосфатаз) приводит к усилению или торможению активности ферментов, обуславливающих эффекты инсулина, путем фосфорилирования или дефосфорилирования. Например, инсулин оказывает стимулирующий эффект на гликогенобразование, повышая активность гликогенсинтетазы (дефосфорилированием) и ингибируя гликогенфосфорилазу.
2) Эффекты
инсулина, как уже упоминалось,
могут также модулироваться
Список литературы