Получение ферментных препаратов

   ПОЛУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

   В настоящее время около 140 ферментов  получено в кристаллическом состоянии. 
Источниками выделения ферментов являются различные животные и растительные ткани, 
а также дрожжи и микроорганизмы. Из одних только плесневых грибов получено около 
80 различных ферментных препаратов: амилолитических, протеолитических и 
пектолитических, нашедших широкое применение в народном хозяйстве. Существует 
несколько методов получения ферментных препаратов. Основной — извлечение фермента 
водой на холоду из тканей, высушенных каким-либо обезвоживающим веществом, 
ацетоном или солевыми растворами. Хорошо измельченные и высушенные препараты 
тканей долгое время могут служить источником получения ферментов. Для получения 
более чистых препаратов сухой порошок ткани экстрагируют водой (или глицерином), 
отделяют жидкость центрифугированием. Ферменты водного экстракта либо осаждают 
ацетоном, осадок отделяют и высушивают, либо водный экстракт подвергают лиофильной сушке. Полученный порошок гигроскопичен, его нужно хранить в запаянных 
ампулах или в герметически закупоренных баночках в холодном месте. Для получения 
чистых препаратов ферментов широко используют в настоящее время такие эффективные 
методы, как электрофорез и ионообменную хроматографию. При сочетании этих методов 
с методами адсорбции и дробного высаливания белков, применявшимися ранее для 
очистки ферментов, значительно возросли возможности препаративного получения 
чистых ферментов.

   КАЧЕСТВЕННЫЕ  ПРОБЫ НА ПРИСУТСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ

   2. Открытие альдегиддегидрогеназы в сыром молоке

   Альдегиддегидрогеназа молока способна окислять ряд субстратов, таких, как формальдегид и другие альдегиды алифатического ряда. Коферментом  альдегиддегидрогеназы является ФАД (флавинадениндинуклеотид). Существуют многочисленные вещества, которые, будучи добавлены в реакционную смесь, легко принимают на себя водород (промежуточные акцепторы водорода). Особенно интересны некоторые красители, которые, присоединяя к себе водород, обесцвечиваются. Так, например, метиленовая синь, присоединяя водород (восстанавливаясь) от субстрата при его окислении под действием альдегиддегидрогеназы, переходит в бесцветное соединение (лейкосоединение). При взбалтывании на воздухе бесцветная форма метиленовой сини отдает принятый водород кислороду воздуха (окисляется) и снова приобретает свою окраску.

   Материалы, реактивы, оборудование. Свежее коровье  молоко; 0,4%-ный раствор формальдегида; 0,01 %-ный раствор метиленовой сини; водяная баня. В три пробирки наливают приблизительно по 5 мл свежего коровьего  молока. Одну пробу кипятят в течение 2 – 3 минут и остужают. В прокипяченную пробу (№ 1) и в одну из некипяченых проб (№ 2) добавляют по 1 мл 0,4%-ного раствора формалина, а в пробу № 3 – 1 мл воды. Во все три пробы приливают по 1 мл метиленовой сини. Содержимое хорошо перемешивают и доливают сверху 3 – 7 4 капли вазелинового масла, чтобы предохранить жидкость от соприкосновения с кислородом воздуха. Пробы помешают в водяную баню, нагретую до 40°С. Через некоторое время жидкость в той из некипяченых проб, в которую был добавлен формалин, обесцвечивается. Обесцвечивание обусловлено восстановлением за счет атомов водорода, который при участии альдегиддегидрогеназы молока отщепляется от формальдегида, превращающегося при этом в муравьиную кислоту.

   Если  затем бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть на воздухе, то раствор  вновь приобретает синий цвет, так как восстановленная форма (донатор водорода) отдает водород  кислороду воздуха с образованием перекиси водорода: МС∙Н₂+0₂ →МС+Н₂0₂

   В прокипяченной пробе и некипяченой  пробе (без добавления формальдегида) обесцвечивания метиленового синего не происходит вследствие отсутствия активного  фермента в первой и отсутствия субстрата  во второй. (Схему опыта см. в табл.)

   Таблица

   Схема опыта Определение дегидрогеназы молока

   3. Открытие пероксидазы  в картофеле

        Пероксидаза катализирует окисление перекисью водорода различных полифенолов и ароматических аминов.

                   Н

    Субстрат        +Н₂О₂                        → Окисленный субстрат + 2Н₂О

                     Н

   Пероксидаза распространена в растительных тканях, особенно в хрене. В животном организме она почти не встречается, в небольших количествах ее можно обнаружить лишь в лейкоцитах и в молоке. Пероксидаза — сложный железосодержащий белок, простетическая группа которого близка к гему гемоглобина. Железо в пероксидазе трехвалентно. Ее обнаруживают при помощи гваяковой настойки (синяя окраска) или по появлению пурпурогаллина (желто-бурый осадок).

   Материалы, оборудование, реактивы. Сырой картофель; 1%-ный раствор пирогаллола; 2%-ный  раствор перекиси водорода.

   Картофель натирают на терке. Небольшое количество его с водой переносят в пробирку, добавляют 1—2 мл 1%-ного раствора пирогаллола и 1—2 капли 2%-ного раствора перекиси водорода. При стоянии выпадает желто-бурый осадок пурпурогаллина. Образование пурпурогаллина происходит следующим образом:

                                                                        Пурпурогаллин

                                                                             ( триоксибензо-aβ-трополон) 

   ОБЩИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

     Ферменты как биологические катализаторы характеризуются признаками как гомогенных, так и гетерогенных катализаторов, а именно они проявляют обычно свое каталитическое действие в водных растворах, но ввиду большого молекулярного веса (от десятков до сотен тысяч у. е.) в растворе ферментов существует микроповерхность раздела, характерная для гетерогенных катализаторов. Каталитическая активность ферментов определяется наличием на их поверхности особых участков — активных центров (участков с определенным сочетанием аминокислот в третичной структуре молекулы), обладающих специфической реакционной способностью. Многие ферменты, например ферменты переноса электронов в окислительно-восстановительных реакциях, ферменты, участвующие в биосинтезе белка, функционируют, будучи «вмонтированными» в сравнительно жесткие структурные компоненты клетки, обладающие макроповерхностью раздела (митохондрии, рибосомы и т. п.). Наряду с общими признаками как гомогенных, так и гетерогенных катализаторов ферменты обладают рядом особых свойств, отличающих их от катализаторов небиологической природы.

   Главные отличия ферментов состоят в  исключительно высокой каталитической активности и ярко выраженной специфичности  действия. Причины этого лежат  в особенностях строения и механизма  действия ферментов. Как известно, скорость реакции зависит от величины энергетического барьера (энергии активации), который должен быть преодолен реагирующими веществами. Ферменты, как и катализаторы, вообще, влияют на энергию активации, снижая ее, однако в случае ферментов, как правило, достигается относительно большее снижение энергии активации. Это дает огромное возрастание скорости реакции при действии ферментов.

   Характерной особенностью ферментативного катализа является его мультиплетность (полифункциональность), т. е. одновременное участие в реакции нескольких (обычно более трех) группировок активного центра и соответственно субстратов. Согласованность каталитического действия всех необходимых групп активного центра достигается в ферментах благодаря упорядоченному их расположению в белковой молекуле. Наличие в активном центре фермента на определенном расстоянии друг от друга группировок, характеризующихся электронодонорными и электроноакцепторными свойствами приводит к тому, что при взаимодействии с соответствующими группировкам у субстратов образуются стабилизированные комплексы, и каталитическая реакция происходит внутримолекулярно. Такие реакции, естественно, требуют значительно меньшей энергии активации. 

   4. Специфичность действия  ферментов

   Специфичность действия ферментов выражается в том, что каждый фермент действует лишь на определенный субстрат или на определенный тип химической связи в молекуле. Если связь или химическая группировка, на которую воздействует данный фермент, встречается в различных соединениях, то все эти соединения будут изменяться под влиянием одного и того же фермента (групповая специфичность). Например, фермент сахараза разрывает р-гликозидную связь и в молекуле сахарозы, и в молекуле рафинозы. Напротив, некоторые ферменты обладают строго абсолютной специфичностью (например, уреаза). Специфичность действия ферментов выражается часто и в том, что при наличии нескольких стереоизомеров фермент действует только на один из них (стереоспецифичность). Так, фермент глюкозооксидаза окисляет только лишь р4Э-глюкозу. превращая ее в б-глюконолактон.

   Специфичность действия объясняют в настоящее  время строгой комплементарностью структуры активного центра фермента структуре субстрата, те. фермент оказывается активным катализатором химических превращений лишь таких веществ, в структуре которых имеются определенные по электронной и стерической характеристике функциональные группы, расположенные в пространстве строго определенным образом. Комплементарность — это динамическое свойство активных центров фермента, так как именно при сближении субстрата с активным центром фермента вследствие их взаимного влияния происходит трансформация структуры обеих реагирующих молекул, благодаря чему достигается наибольший каталитический эффект.

   а) Амилаза и сахараза

   Материалы, реактивы. Разбавленный раствор слюны (1:10); 0,5%-ный раствор крахмала; раствор  дрожжевой сахаразы; 2%-ный раствор  тростникового сахара; 1%-ный раствор сернокислой меди; 10%-ный раствор едкого натра; раствор йода в йодистом калии; пипетки на 2 мл; термометр на 100°С. 

   Ход определения. Нумеруют 4 пробирки. В  пробирки 1 и 2 наливают по 2 мл раствора крахмала; в пробирки 3 и 4 — по 2 мл раствора сахарозы. Затем в пробирки 1 и 3 вносят по 0,5 мл слюны, а в пробирки 2 и 4 — по 0,5 мл раствора дрожжевой сахаразы. Перемешивают содержимое и ставят на 10 минут в водяную баню, нагретую до 38—40°С. После охлаждения проделывают реакции с йодом и на восстановление гидрата окиси меди. О чем свидетельствуют результаты опыта? 

   5. Влияние температуры на активность ферментов

   Скорость  ферментативных реакций, как и большинства  любых химических процессов, увеличивается  при нагревании. Однако, в отличие  от неферментативных реакций, это увеличение скорости в случае ферментов наблюдается в сравнительно узком температурном интервале. По достижении некоторой температуры, характерной для каждого фермента, скорость реакции достигает максимального значения, после чего с повышением температуры падает. Температура, соответствующая максимальной скорости, называется оптимальной (Т опт).

   Для большинства ферментов, выделенных от теплокровных животных, такой оптимальной температурой является 37 – 40°С. Уменьшение скорости ферментативной реакции при температурах, более высоких, чем оптимальная, объясняется термолабильностью ферментов, т.е. чувствительностью к действию высокой температуры. Как правило, ферментативные процессы не могут протекать при температуре выше 70°С. Степень инактивации фермента зависит не только от температуры, но и от длительности теплового воздействия. Уменьшение скорости ферментативной реакции при повышении температуры объясняется неспецифической тепловой денатурацией белковой молекулы фермента и потерей вследствие этого каталитической активности.

   При более низких температурах скорость ферментативного катализа замедляется, падая

   при 0°С до очень малой величины.

   Влияние температуры на активность амилазы слюны

   Материалы, реактивы, посуда. 1%-ный раствор крахмала; слюна, фильтрованная и разбавленная (1:10); раствор йода в йодистом калии; едкий натр, 10%-ный раствор; медь сернокислая, 1%ный раствор; водяная баня; пипетки на 1 и 2 мл; стеклянные палочки; фарфоровая пластинка.