Получение ферментных препаратов

   В четыре пронумерованные пробирки наливают по 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала. Пробирку 1 помешают в кипящую баню; пробирку 2 – в баню при 40°С; пробирку 3 оставляют на рабочем столе (при комнатной температуре); пробирку 4 помещают в лед. В течение 10 минут содержимое пробирок принимает температуру окружающей среды. Далее во все пробирки добавляют по 0,5 мл слюны (разбавленной в 10 раз), перемешивают и оставляют в тех же условиях. Наблюдение за ходом гидролиза осуществляют с помощью йодной реакции. Для этого наносят на фарфоровую пластинку несколько капель раствора йода в йодистом калии и смешивают их с каплями гидролизуемой смеси из каждой пробирки, беря пробы через 1, 2, 4, 6, 8 минут. По изменении окраски крахмала с йодом судят о степени гидролиза. Схема опыта приведена в таблице: 

   6. Действие активаторов и ингибиторов на ферменты

   Помимо температуры и рН, большое влияние на активность ферментов оказывает присутствие в растворе ряда химических соединений. Одни из таких соединений повышают активность ферментов (активаторы), другие, напротив, действуют на них угнетающим образом (ингибиторы, или парализаторы).

   а) Действие активаторов  и парализаторов на амилазу слюны

   Материалы, оборудование, реактивы. Слюна профильтрованная; 0,5%-ный раствор крахмала; 1%-ный раствор поваренной соли; 1%-ный раствор сернокислой меди; раствор йода в йодистом калии; бюретка на 50 мл; пипетки на 2 мл и 1 мл; водяная баня термометр на 100°С.

   Ход определения. В качестве активатора амилазы слюны используют 1%ный  раствор хлористого натрия; в качестве парализатора — 1%-ный раствор сернокислой меди Активатором следует считать то вещество, в присутствии которого меньшее количества фермента (по сравнению с контролем) будет активно, а вещество, в присутствии которого активность фермента понижается или прекращается совсем, является ингибитором 1 (па рал из агорой).

   Приготовьте три ряда пронумерованных пробирок, по 10 в каждом ряду. Во все пробирки влить из бюретки по 1 мл воды; затем в первые каждого ряда — по 1 мл фильтрованной неразбавленной слюны. Содержимое пробирки хорошо перемешать. Далее 1 мл смеси из пробирки 1 (в каждом ряду) переносят в пробирку 2, перемешивают, снова набирают 1 мл смеси и переносят в пробирку 3 и т.д. вплоть до пробирки 10, из которой после перемешивания выливают 1 мл жидкости (степень разбавления возрастает). Во все пробирки I ряда наливают по 1 мл воды (контрольный ряд); в пробирки II ряда — по 1 мл раствора хлористого натрия и в пробирки III ряда — по 1 мл раствора сернокислой меди. Далее во все пробирки наливают из бюретки по 2 мл раствора крахмала в следующем порядке: сначала в первые номера всех рядов, затем во вторые и т.д. Содержимое перемешивают и ставят в водяную баню на 15 минут при 38 – 40°С. Затем все пробирки вынимают, охлаждают и ставят в штатив по порядку, после чего в каждую из них добавляют по капле раствора йода, перемешивают, отмечают в каждом ряду последнюю пробирку, в которой отсутствует реакция йода на крахмал, и вычисляют в ней концентрацию слюны. Активность фермента обратно пропорциональна количеству слюны, при котором еще наблюдается расщепление крахмала.

   б) Ингибирующее действие иона хлора на дегидрогеназы картофеля

   Материалы, оборудование, реактивы. Кристаллическая  поваренная соль; кристаллический йодистый натрий; порошок бертолетовой соли; картофель (или яблоко). Две картофелины  разрезают пополам. Одну половину оставляют  для контроля; вторую посыпают поваренной солью; третью—йодистым натрием; четвертую — бертолетовой солью Оставляют материал на воздухе на 15—20 минут. За это время срезы трех половинок темнеют, а срез с поваренной солью остается без изменения. Объясните результаты опыта.

   в) Конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназной активности

   Материалы, оборудование, реактивы. Мышечная кашица; 1%-ный раствор малоновой кислоты (предварительно нейтрализованный щелочью); 1%ный раствор янтарной кислоты; 1%-ный раствор метиленовой сини; вазелиновое масло; водяная баня; пипетки на 1 мл. В три пронумерованные пробирки помещают 3 – 4 мл мышечной кашицы и добавляют: в первую – 0,4 мл воды; во вторую – 0,2 мл 1%-ного раствора малоновой кислоты и 0,2 мл воды и в третью – 0,4 мл 1%-ного раствора малоновой кислоты. Во все три пробирки добавляют по 1 мл 1%ного раствора янтарной кислоты, по 2 – 3 капли 1%-ного раствора метиленовой сини и после перемешивания 3 – 4 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню, нагретую до 40°С. Через 3 – 5 минут наблюдается почти полное исчезновение голубой окраски в пробирке № 1; некоторое уменьшение интенсивности окраски происходит во второй пробирке; в пробирке № 3 – голубая окраска сохраняется полностью.

   Сукцинатдегидрогеназная активность тормозится в присутствии малоновой кислоты, являющейся структурным аналогом янтарной кислоты:

             НООС-СН2-СН2-СООН                              НООС-СН2-СООН

                  малоновая кислота                                       янтарная кислота