Вопрос  № 1

     Электронная микроскопия. Принципы устройства и  работы электронного микроскопа. Преимущества и недостатки метода. 

     Стр 36 Ченцов

     Рассматривая  характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 1 А (0,1 нм). По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку.

     Основная  часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр (колонка микроскопа), из которого откачан воздух для того, чтобы не было взаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити накаливания в катоде электронной пушки. Между катодом и анодом подается высокое напряжение (от 50 до 200-5000 кВ), что служит причиной ускорения электронов. В центре анода есть отверстие, проходя через которое электроны формируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа.  

     Линзы электронного микроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменять путь электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). В конденсорной линзе пучок электронов фиксируется и попадает на объект, с которым электроны взаимодействуют, отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменения. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной линзой, которая формирует увеличенное первичное изображение объекта. Так же как в световом микроскопе, объективная линза определяет его основные показатели. Первичное изображение увеличивается проекционной линзой и проецируется на экран, покрытый люминесцентным слоем, светящимся при попадании на него электронов. Вместо светящегося экрана изображение можно поместить на фотопластинку и получить снимок.

     Напряжение, которое используется для ускорения электронов в большинстве просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов, достигает 50-150 кВ. При напряжении в 50 кВ электрон обладает длиной волны в 0,05 А, и в этом случае теоретически можно было бы получить разрешение в 0,025 А (d ~ 0,5 l). Однако в современных конструкциях электронных микроскопов достигается разрешение около 1 А из-за  недостаточной стабильности напряжения, стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линз и других несовершенств прибора (теоретически возможно еще повысить разрешение электронного микроскопа в 100 раз). Но и достигнутое разрешение огромно (вспомним, что величина О-Н связи  в молекуле воды равна 0,99 А): оно сейчас уже в 106 раз выше разрешающей способности глаза! 
 
 

     На  экранах и фотопластинках электронных микроскопов можно получить увеличение до 50 000 раз, в дальнейшем при фотопечати можно получить еще 10-кратное увеличение, так что конечное увеличение, при котором максимально реализуется разрешение, может достигать 106 раз (например, если 1 мм увеличить в 106 раз, то он достигнет длины в 1 км).

     В настоящее время электронно-микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры передается прямо в компьютер, где  на экране монитора его можно обрабатывать различным образом (изменять увеличение, контрастность изображения, применять денситометрию, плани- и морфометрию отдельных компонентов). Используя принтер можно получить отпечатки полученных изображений.

     Максимальное  разрешение электронного микроскопа (ЭМ) реализуется сейчас только при исследовании металлов или кристаллических решеток. На биологических объектах такого разрешения получить пока не удается из-за низкой контрастности объекта. Биологические объекты для исследования в ЭМ помещаются на медные сеточки, покрытые тонкими пленками – подложками (формвар, коллодий, углерод), состоящими в основном из углерода. Биологические объекты также в основном содержат углерод и, следовательно, мало по плотности будут отличаться от фона, будут мало контрастны. Показано, что минимальная толщина биологического объекта с плотностью около 1 г/см3, выявляемого при ускоряющем напряжении в электронном микроскопе 50 кВ, равна 50 А. Вирусы, расположенные на поддерживающей пленке, будут видны в этом случае в виде бесструктурных пятен, а молекулы нуклеиновых кислот (толщина ДНК равна 20 А ) вообще не видны из-за низкого контраста. Контраст биологических объектов можно повысить, используя тяжелые металлы или их соли.

 

      Вопрос № 2

     Пластиды  клеточных растений: хлоро-, хромо-, и лейкопласты, пропластиды. Хлоро-, хромо-, и лейкопласты, пропластиды. Хлоропласты: ультраструктура и функции. Фотосинтез, основные его этапы. Происхождение пластид и их роль в цитоплазматической наследственности. (ответ иллюстрировать рисунками). 

     Пластиды  – Органоиды общего значения в растительных клетках, эвглены зеленой (простейшие) (рис. 1). Различают: хлоропласты, хромопласты, лейкопласты.

     Хлоропласты – зеленые пластиды, окруженные двумя мембранами. Внутренний слой мембраны в полости хлоропласта  образуют плоские мешочки – тилокоиды. Они дисководной формы, образуют стопку ≈ 50 штук, стопки называются гранулами. В хлоропласте 40-60 гранул. Пространство между тилакоидами заполнено стромой (матриксном) хлоропласта из белков, липидов, углеводов, ферментов, АТФ, ДНК, РНК, рибосом. Хлоропласты образуются из пропластид – небольших недифференцированных телец. Хлоропласты размножаются путем деления. Хлоропласты могут превращаться осенью в хромопласты и лейкопласты. [1] 

     

     Рис. 1. строение хлоропласта (а), лейкопласта (б), амилопласта (в) и хромопласта (г)

     1 – внешняя мембрана; 2 – внутренняя  мембрана; 3 – матрикс (строма); 4 –  ламеллы стромы; 5 – грана; 6 –  тилакоид; 7 – крахмальное зерно; 8 – липидная капля с пигментами 

     Хлоропалсты представляют собой структуры, ограниченные двумя мембранами – внутренней и внешней. Внешняя мембрана, как и внутренняя, имеет толщину около 7 мкм, они отделены друг от друга межмембранным пространством ококло 20-30 нм. Внутренняя мембрана хлоропластов отделяет строму пластиды, аналогичную матриксу митохондирий. В строме зрелого хлоропласта высших растений видны два типа внутренних мембран. Это – мембраны, образующие плоские, протяжные ламеллы стромы, и мембраны тилакоидов – плоских дисковидных вакуолей, или мешков.

     Ламеллы стромы (толщиной околого 20 мкм) представляют собой плоские полые мешки или же имеют вид сети из разветвленных и связанных друг с другом каналов, располагающихся в одной плоскости. Обычно ламеллы стромы внутри хлоропласта лежат параллельно друг другу и не образуют связей между собой.

     Кроме мембран стромы в хлоропластах обнаруживаются мембранные тилакоиды. Это плоские  замкнутые мембранные мешки, имеющие  форму диска. Величина межмембранного пространства у них также около 20-30 нм. Таки тилакоиды образуют стопки наподобие столбика моент, называемые граными (рис. 2). Число тилакоидов на одну грану очень варьирует: от нескольких штук до 50 и более. Размер таких стопок может достигать 0,5 мкм, поэтому граны видны в некоторых объектах в световом микроскопе. Количество гран в хлоропластах высших растений может достигать 40-60. Тилакоиды в гране сближены друг с другом так, что внешние слои их мембран тесно соединяются; в месте соединения мембран тилакоидов образуется плотный слой толщиной около 2 нм. В состав граны кроме замкнутых камер тилакоидов обычно входят и участки ламелл, которые в местах контакта их мембран с мембранами тилакоидов тоже образуют плотные слои толщиной 2 нм. Ламеллы стромы, таким образом, как бы связывают между собой отдельные граны хлоропласта. Однако полости камер тилакоидов всегда замкнуты и не прееходят в камеры межмембранного пространства ламелл стромы. Ламеллы стромы и мембраны тилакоидов образуются путем отделения от внутренней мембраны при начальных этапах развития пластид.

     В матриксе (строме) хлоропластов обнаруживаются молекулы ДНК, рибосомы; там же происходит первично отложение запасного полисахарида – крахмала, в виде крахмальных зерен.

     

     Рис. 2. Стомы граны

     а – общий вид; б – схема разреза; 1 – тилакоид; 2 – ламелла стромы; 3 – участок спаренных мембран 

     Функции хлоропластов:

     Фотосинтез 

     Синтез  собственных белков.

     

     Рис. 2. Схема основных функций хлоропласта

     Световые  реакции локализованы в тилакоидах (1), темновые – в матриксе (2)

     Хлоропласты – это структуры, в которых  осуществляются фотосинтетические  процессы, приводящие в конечном итоге к связыванию углекислоты, к выделению кислороду и синтезу сахаров.

     Характерным для хлоропластов является наличие  в них пигментов хлорофиллов, которые и придают окраску  зеленым растениям. При помощи хлорофилла зеленые растения поглощают энергию солнечного света и превращают ее в химическую. Поглощение света с определенной длиной волны приводит к изменению в структуре молекулы хлорофилла, при этом она переходит в возбужденное, активированное состояние. Освобождающаяся энергия активированного хлорофилла через ряд промежуточных этапов предеает определенным синтетическим процессам, приводящим к синтезу АТФ и к восстановлению акцептора электронов НАДФН до НАФН-Н, которые тратятся в реакции связывания СО₂ и синтезе сахаров.

     Лейкопласты – бесцветные пластиды в неокрашенных частях растений: клетках, эндосперме семян, клубнях,, корнеплодах. Это двухмембранные органоиды, внутри 2-3 выроста. Форма округлая. Переходят в хлоропласты и хромопласты.

     Функция:

     Накопление  питательных веществ – крахмала, жиров, белков.

     Хромопласты – двухмембранные пластиды нитевой, пластинчатой или иной формы. Цвет желто-красно-коричнево-оранжевый  за счет пигментов каротиноидов. Находятся  в клетках плодов. Хромопласты  – конечный этап в развитии пластид - в них превращаются хлоропласты и лейкопласты.

     Функция:

     В клетке: играют роль своеобразного  светофильтра для хлоропластов в  процессе фотосинтеза; местосинтеза и  локализации растительных пигментов.

     Окраска венчиков цветов – привлекающие насекомых  опылителей.

     Окраска плодов – привлечение животных – распространение семян.

     Фотосинтез  – процесс образования органических веществ в хлоропластах из неорганических веществ под действием света.

     Фотосинтез  состоит из световой и темновой фазы. Реакции на свету протекают в  гранах (тилакоидах), реакции, не требующих света, темновые – в строме хлоропластов.

     Световые  реакции:

     А. Свет возбуждает молекулы хлорофилла мембранах тилакоидов, электроны  сходят с орбит и переносятся  за пределы мембраны тилакоидов, создавая заряженное электрическое поле.

     В. Место вышедших электронов, занимают электроны, занимают электроны образовавшиеся в результате разложения воды под  светом (фотолиза):

          С.  ОН объединяются в воду и кислород, который выделяется в атмосферу.

     Протоны Н+ не проникают через мембрану тилакоида  и накапливаются внутри, образуя  положительно заряженное электрическое  поле, что приводит к Δφ по обе  стороны мембраны. Пари достижения критической разности потенциалов  Н+ устремляются по протонному каналу в ферменте АТФ-синтеазе, встроенный в мембрану тилакоида, наружу. На выходе создается высокий уровень энергии, который идет на синтез АТФ из АДФ с присоединением фосфата. Образовавшиеся молекулы переходят в строму, где участвуют в реакциях фиксации углерода.

     Н⁺ вышедшие на поверхность мембраны тилакоида, соединяются с электронами, образуя атомарный водород, который идет на восстановление переносчика НАДФ⁺:

     Активированный  световой энергией электрон хлорофилла используется для присоединения водорода к НАДФН, переходит в строму хлоропласта, участвуя в реакциях фиксации углерода.

     Темновые  реакции:

     Темновая  фаза фотосинтеза представляет собой  ряд последовательных реакций. В  результате этих реакций из СО₂ и Н₂О образуются углеводы.