При пользовании простыми предметными  стеклами материал (физиологический  раствор и культуру) наносят на предметное стекло, которое покрывают  покровным. Капельки материала надо брать такой величины, чтобы они  заполняли все пространство между  покровным и предметным стеклом  и не выступали за края покровного. Препарат можно рассматривать как  с сухими системами, так и с  иммерсионной. Очень хорошо рассматривать  живые бактерии с помощью фазово-контрастной  или аноптральной установки. Препараты на простых предметных стеклах быстро высыхают, поэтому, если их приходится рассматривать не тотчас, а спустя некоторое время, их помещают во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2—3 влажных кружка фильтровальной бумаги, покрытых двумя сухими.

    Метод  «раздавленной»  капли.  На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х. После микроскопии препараты «раздавленной» капли или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

    Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок. При таком распределении материала в мазке при микроскопии можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидком виде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать. Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 15-20 мин. в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт и другие фиксирующие жидкости.

 

Методы  окраски мазков

    Простой метод.

    Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним  красителем, например фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

    Сложные методы. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоты и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Окрас методом Грама является сложным методом.

    

    Рис.2. Окрас методом Грама (схема).  

• На фиксированный  мазок нанести карболово-спиртовой  раствор генцианового фиолетового  через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель  слить.
• Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.
• Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
• Промыть водой.
• Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

    Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет,  грамотрицательные - в красный.

 

Питательные среды для бактерий

 

    В лабораторных или производственных условиях бактерии выращивают (культивируют) на средах, которые должны удовлетворять потребности бактерий в питательных веществах, иметь адекватное значение величины рН, изотоничность и быть стерильными, а по-возможности и прозрачными. Специфичность большинства питательных сред определяют соединения углерода и азота, но так как конструктивные и энергетические процессы микроорганизмов разнообразны, неодинаковы и их потребности в питательных веществах.

    Питательные среды принято делить на несколько  групп: среды, которые отличаются по составу и происхождению, физическому состоянию или консистенции и функциональному или целевому назначению. По происхождению среды бывают естественными (натуральными) и искусственными (синтетическими). К естественным средам относят те, в состав которых входят продукты растительного или животного происхождения. Они содержат все компоненты, необходимые для роста и развития бактерий, но имеют непостоянный химический состав, то есть они нестабильны. Поэтому такие питательные среды не пригодны для изучения метаболизма бактерий, а используются, в основном, для накопления биомассы, поддержания культур бактерий в жизнеспособном состоянии и для диагностических целей, например, для выделений чистых культур бактерий. К естественным средам относятся молоко, кровь и сыворотка крови, отвары и экстракты из природных субстратов, пептонная и мясная вода, мясо-пептонные бульон и агар, дрожжевые экстракты, картофельные, яичные и желчесодержащие среды. Синтетические (искусственные) среды имеют определенный химический состав и точное количественное содержание питательных веществ. Их используют для изучения метаболизма бактерий, исследования физиологии и биохимии микроорганизмов. Примером синтетической среды могут служить среды Козера и Симмонса, используемые для изучения способности бактерий утилизировать цитраты. В состав этих сред, наряду с другими солями, входят цитрат натрия и индикатор. В практике микробиологии, как правило, используются комбинированные питательные среды, в которых сочетаются естественные компоненты с неорганическими солями. Примерами таких сред являются агар Цейсслера, в состав которого входит МПА, кровь и сахар, среды Гисса, содержащие пептон, агар, один из сахаров и индикатор, среда Раппопорта, состоящая из желчного бульона, глюкозы и индикатора.

    Среды можно по составу разделить так  же на простые и сложные. К простым относятся мясная и пептонная вода, мясо-пептонные бульон и агар. Добавление к таким средам одного или нескольких ингредиентов – углеводов, крови, сыворотки и других составляющих делают их сложными.

    По  физическому состоянию питательные  среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными или твердыми, сыпучими или сухими. Жидкие среды представлены, как правило, водными растворами необходимых для жизни веществ. Их используют для накопления биомассы, обогащения культур бактерий, изучения метаболизма. Полужидкие и плотные питательные среды получают из жидких, добавляя к ним агар или желатину. Концентрация агара для полужидких сред 0,5-0,7%, а для плотных 1,5-2%. Полисахарид агар получают из некоторых видов морских водорослей, его высушивают и хранят в виде пластин или порошка. Бактерии не используют агар в качестве субстрата, и поэтому состав плотной питательной среды зависит от состава жидкой среды, к которой добавлен агар. Агаризированные среды разливают в пробирки или чашки Петри в расплавленном состоянии, а затем охлаждают. Для уплотнения сред иногда используют желатин, добавляя ее к жидким средам в 10-20% концентрации. Применение желатина ограничено тем, что она разжижается протеолитическими ферментами бактерий и ее применяют, в основном, в питательных средах для диагностических целей. Для уплотнения сред используют, кроме того, селикагель и каррагенан, получаемый из красных морских водорослей. Сухие питательные среды представляют смеси составляющих питательных сред определенного состава. Перед использованием их растворяют в воде в соответствии с инструкцией, указанной на этикетке, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют. Применение сухих питательных сред облегчает работу по приготовлению сложных сред в лабораториях.

    По  целевому назначению питательные среды  делят на несколько групп:

1. основные или универсальные простые среды, например, МПА, МПБ; на них могут расти многие виды неприхотливых микроорганизмов;
2. специальные или сложные среды используют для культивирования тех бактерий, которые не могут расти на основных простых средах;

    В состав специальных сред вводят, например, углеводы для роста стрептококков, желчь для культивирования сальмонелл. Среди сложных сред можно выделить избирательные или элективные среды. Они предназначены для выделения и культивирования определенного вида бактерий из материала, содержащего большое количество разных видов микроорганизмов. Например, для выделения возбудителя туберкулеза из мокроты больного используют среду Левинштейна-Йенсена, сальмонелл из испражнений – среду Плоскирева. В сложном составе таких сред содержатся вещества, ингибирующие рост посторонней микрофлоры, но не влияющие на жизнедеятельность искомого вида бактерий. Разновидность элективных – селективные питательные среды. В их состав входят не только вещества, подавляющие рост отдельных групп микроорганизмов, но и стимуляторы роста отдельных видов бактерий. Дифференциально-диагностические среды предназначены для идентификации бактерий по биохимическим свойствам. В основе использования этих сред лежат различия в ферментативном составе бактерий и способности ферментов расщеплять тот или иной субстрат. Способность бактерий к выделению токсинов и ферментов исследуют на кровяных агарах, желточно-солевом агаре, безсывороточном фосфатном агаре и других подобных средах. Консервирующие среды используют для транспортировки и хранения в течение длительного времени материала, содержащего бактерии. В их состав входят глицерин, хлорид натрия и фосфатно-буферные растворы.

    Питательные среды стерилизуют в автоклавах при разных режимах, которые зависят от состава среды или, если питательные среды содержат термолабильные компоненты, путем стерилизующей фильтрации.

Условия культивирования  бактерий

    Для роста бактерий, кроме состава  питательной среды, имеют значение кислотность среды, аэрация, температура, свет и влажность. Большинство бактерий растет при рН – 6,8-8,0, то есть в нейтральной среде. Поддержание нейтрального значения рН, особенно важно для кислотопродуцирующих бактерий. В процессе промышленного культивирования бактерий в больших объемах, рН среды регулируется автоматически добавлением растворов бикарбоната натрия или щелочей. Газовый состав среды также важен для бактерий. Значительная часть из них нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы объединены в группу облигатных аэробов. Меньшая часть бактерий - облигатные анаэробы – способны развиваться только в отсутствии кислорода. Однако, большинство бактерий – факультативные анаэробы, они растут как в присутствии кислорода, так и без него. Для бактерий, культивируемых на плотных питательных средах или в небольших объемах жидких сред достаточно кислорода, присутствующего в атмосфере. Для культивирования бактерий – аэробов в промышленных масштабах требуется принудительная аэрация путем продувания кислорода в реактор или ферментёр с культурой, а для культивирования анаэробов – создание безкислородных условий. Для этого бактерии засевают уколом в столбик плотной питательной среды, помещают посевы в специальные приборы – анаэростаты, где газовая фаза представлена инертным газом или создан вакуум, а кислород из среды удаляют с помощью кипячения или химических методов.

    Большинство известных микроорганизмов относится  к мезофилам, температурный оптимум для которых лежит в интервале 25-370С. Термофилы способны расти при 45-900С, а психрофилы остаются жизнеспособными при 5 - 100С. Отклонение температурного режима от оптимального неблагоприятно сказывается на жизнедеятельности бактерий. Поэтому культивирование их осуществляют в специальных шкафах – термостатах или термостатированных комнатах, где поддерживается оптимальная заданная температура.

    Изотоничность питательной среды зависит от содержания неорганических солей. Для большинства бактерий изотоничной считается среда, концентрация натрия хлорида в которой составляет 0,5-0,6 %. Время выращивания (культивирования) бактерий зависит от времени очередного деления клеток данной популяции. Периоды генерации большинства патогенных бактерий составляют несколько (4-8) часов. Такие культуры формируются в течение 18-24 часов. Клетки некоторых видов бактерий делятся с большими временными интервалами, поэтому увеличение численности популяций таких культур происходит в течение длительного времени[3].

Характеристика культуры по морфологическим и тинкториальным признакам

    При микроскопии мазков изучают морфологические  и тинкториальные свойства культур  бактерий: форму, структуру и размер клеток, наличие спор, капсулы, жгутиков, пилей, расположение клеток относительно друг друга, цвет в соответствии с использованными методами окраски, наличие и характер подвижности [4].

     

Рис. 3. Стрептококки (род. Streptococcus), стафилококки (род Staphylococcus), менингококки (род Neisseria).

Рис. 4. Кишечная палочка (род. Escherichia), дифтерийная палочка (род Corynebacterium), микобактерии туберкулеза (род Mycobacterium).

Рис. 5. Возбудитель сибирской язвы (род Bacillus), возбудитель газовой гангрены (род Clostridium).

 

Культурные  признаки (колонии  на МПА)

 

Рассматриваемая культура на МПА определена как Vibrio cholerae.

Форма колоний: __неправильная______________________

Величина: _1 крупная колония и несколько мелких: 48+200+17+7=265 КОЕ (колониеобразующих единиц) На 1 см² – 200 КОЕ_________

Прозрачность: ______мучнистая (не прозрачная)_________

Цвет: _____желтовато-белая___________________________

Характер  поверхности:____шероховатая________________

Высота:_______плоская (1-2 мм)_______________________

Край:_______волнистый______________________________

Структура:___однородная____________________________

Консистенция:__маслообразная________________________

Морфологические признаки

    Перед микроскопированием были проведены  фиксация и окраска по Граму. Использовалось увеличение 100х10. Рассматривали следующие  мазки: E.Coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aurenus, Vibrio cholerae.

    E.Coli

Форма клетки:__ палочковидные, со слегка закруглёнными концами

Взаимное  расположение:__образуют места скоплений, а так же одиночные формы

Размеры:__________ 0,4—0,8 х 1—3 мкм____