Состав нуклеиновых кислот

1.      Состав нуклеиновых кислот

1.      ДНК

2.      РНК

2.      Макромолекулярная структура ДНК

3.      Выделение дезоксирибонуклеиновых кислот

4.      Выделение рибонуклеиновых кислот

5.      Природа межнуклеотидных связей

1.      ДНК

2.      РНК

6.      Нуклеиновые кислоты, их значение

7.      Список литературы

1. Состав нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты представляют собой биополимеры. Их макромолекулы состоят из не однократно повторяющихся звеньев, которые представлены нуклеотидами. И их логично назвали полинуклеотидами. Одной из главных характеристик нуклеиновых кислот является их нуклеотидный состав. В состав нуклеотида (структурного звена нуклеиновых кислот) входят три составные части:

        азотистое основание. Может быть пиримидиновое и пуриновое. В нуклеиновых кислотах содержатся основания 4-х разных видов: два из них относятся к классу пуринов и два – к классу пиримидинов. Азот, содержащийся в кольцах, придает молекулам основные свойства.

        остаток фосфорной кислоты. Нуклеиновые кислоты являются кислотами потому, что в их молекулах содержится фосфорная кислота.

        моносахарид - рибоза или 2-дезоксирибоза. Сахар, входящий в состав нуклеотида, содержит пять углеродных атомов, т.е. представляет собой пентозу. В зависимости от вида пентозы, присутствующей в нуклеотиде, различают два вида нуклеиновых кислот – рибонуклеиновые кислоты (РНК), которые содержат рибозу, и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), содержащие дизоксирибозу.

Нуклеотид по своей сути это фосфорный эфир нуклеозида. В состав нуклеозида входят два компонента: моносахарид (рибоза или дезоксирибоза) и азотистое основание.

На закате 40-х — начале 50-х годов, когда уже стали появляться такие методы исследования, как хроматография на бумаге и УФ-спектроскопия. Подтверждались многочисленные исследования нуклеотидного состава НК (Чаргафф, А. Н. Белозерский). Данные полученные при исследованиях в конец разрушили отжившие и некомпетентные представления о нуклеиновых кислотах, как о полимерах, содержащих повторяющиеся тетрануклеотидные последовательности — тетрануклеотидная теория строения ПК, господствовавшая в 30—40-е годы. Также дали основания для создания современных представлений не только о первичной структуре ДНК и РНК, но и об их макромолекулярной структуре и функциях.

Метод определения состава ПК основан на анализе гидролизатов, образующихся при их ферментативном или химическом расщеплении. Обычно используются три способа химического расщепления НК. Кислотный гидролиз в жестких условиях (70%-ная хлорная кислота, 100° С, 1 ч или 100%-ная муравьиная кислота, 175° C, 2 ч), применяемый для анализа как ДНК, так и РНК, приводит к разрыву всех N-гликозидных связей и образованию смеси пуриновых и пиримидиновых оснований. При исследовании РНК могут использоваться как мягкий кислотный гидролиз (1 н. соляная кислота, lOO° C, 1 ч), в результате которого образуются пуриновые основания и пирамидиповые нуклеозид-2'(3')-фосфаты, так и щелочной гидролиз (0,3 н. едкий кали, 37° С, 20 ч), дающий смесь нуклеозид -2' (3') -фосфатов.

Поскольку в НК число нуклеотидов каждого вида равно числу соответствующих оснований, для установления нуклеотидного состава данной НК достаточно определить количественное соотношение оснований. Для этой цели из гидролизатов с помощью хроматографии на бумаге или электрофореза (когда в результате гидролиза получают нуклеотиды) выделяют индивидуальные соединения. Каждое основание независимо от того, связано оно с углеводным фрагментом или нет, обладает характерным максимумом поглощения в УФ, интенсивность которого зависит от концентрации. По этой причине, исходя из УФ-спектров выделенных соединений, можно определить количественное соотношение оснований, а следовательно, и нуклеотидный состав исходной НК.

При количественном определении минорных нуклеотидов, особенно таких неустойчивых, как дигидроуридиловая кислота, пользуются ферментативными методами гидролиза (ФДЭ змеиного яда и селезенки).

Использование описанных выше аналитических приемов показало, что ПК различного происхождения состоят за редким исключением из четырех основных нуклеотидов и что содержание минорных нуклеотидов может меняться в значительных пределах.

Как будет показано далее, при изучении нуклеотидного состава ДНК были получены данные, которые помогли установить ее пространственную структуру.

1.1. ДНК

При исследовании нуклеотидного состава нативных ДНК различного происхождения Чаргаффом были обнаружены следующие закономерности.

1. Все ДНК независимо от их происхождения содержат одинаковое число пуриновых и пиримидиновых оснований. Следовательно, в любой ДНК на каждый пуриновый нуклеотид приходится один пиримидиновый.

2. Любая ДНК всегда содержит в равных количествах попарно аденин и тимин, гуанин и цитозин, что обычно обозначают как А=Т и G=C. Из этих закономерностей вытекает третья.

3. Количество оснований, содержащих аминогруппы в положении 4 пиримидинового ядра и 6 пуринового (цитозин и аденин), равно количеству оснований, содержащих оксо-группу в тех же положениях (гуанин и тимин), т. е. A+C=G+T. Эти закономерности получили название правил Чаргаффа. Наряду с этим было установлено, что для каждого типа ДНК суммарное содержание гуанина и цитозина не равно суммарному содержанию аденина и тимина, т. е. что (G+C)/(A+T), как правило, отличается от единицы (может быть как больше, так и меньше ее). По этому признаку различают два основных типа ДНК: А  Т-тип с преимущественным содержанием аденина и тимина и G  C-тип с преимущественным содержанием гуанина и цитозина.

Величину отношения содержания суммы гуанина и цитозина к сумме содержания аденина и тимина, характеризующую нуклеотидный состав данного вида ДНК, принято называть коэффициентом специфичности. Каждая ДНК имеет характерный коэффициент специфичности, который может изменяться в пределах от 0,3 до 2,8. При подсчете коэффициента специфичности учитывается содержание минорных Оснований, а также замены основных оснований их производными. Например, при подсчете коэффициента специфичности для ЭДНК зародышей пшеницы, в которой содержится 6% 5-метилцитозина, Последний входит в сумму содержания гуанина (22,7%) и цитозина (16,8%). Смысл правил Чаргаффа для ДНК стал понятным после установления ее пространственной структуры.

1.2. РНК

Первые сведения о нуклеотидном составе РНК относились к препаратам, представляющим собой смеси клеточных РНК (рибосомных, информационных и транспортных) и называемым обычно суммарной фракцией РНК. Правила Чаргаффа в этом случае не соблюдаются, хотя определенное соответствие между содержанием гуанина и цитозина, а также аденина и урацила все же имеет, место.

Данные, полученные в последние годы при анализе индивидуальных РНК, показывают, что и на них правила Чаргаффа не распространяются. Однако различия в содержании аденина и урацила, а также гуанина и цитозина для большинства РНК невелики и что, следовательно, тенденция к выполнению указанных правил все же наблюдается. Этот факт объясняется особенностями макроструктуры РНК.

Характерными структурными элементами некоторых РНК являются минорные основания. Соответствующие им нуклеотидные остатки обычно входят в состав транспортных и некоторых других РНК в очень небольших количествах, поэтому определение полного нуклеотидного состава таких РНК представляет собой иногда весьма сложную задачу.

2. Макромолекулярная структура ДНК

В 1953 г. Уотсон и Крик, опираясь на известные данные о конформации нуклеозидных остатков, о характере межнуклеотидной связи в ДНК и закономерности нуклеотидного состава ДНК (правила Чаргаффа), расшифровали рентгенограммы паракристаллической формы ДНК [так называемой В-формы, образующейся при влажности выше 80% и при высокой концентрации противоионов (Li+) в образце]. Согласно их модели, молекула ДНК представляет собой правильную спираль, образованную двумя полидезоксирибонуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Диаметр спирали практически постоянен вдоль всей ее длины и равен 1,8 нм (18 А).

Макромолекулярная структура ДНК.

(а)—Модель Уотсона — Крика;

(6)—параметры спиралей В-, С- и Т-форм ДНК (проекции перпендикулярно оси спирали);

(в)—поперечный разрез спирали ДНК в В-форме (заштрихованные прямоугольники изображают пары оснований);

(г)—параметры спирали ДНК в А-форме;

(д)—поперечный разрез спирали ДНК в А-форме.

Длина витка спирали, который соответствует ее периоду идентичности, составляет 3,37 нм (33,7 А). На один виток спирали приходится 10 остатков оснований в одной цепи. Расстояние между плоскостями оснований равно, таким образом, примерно 0,34 нм (3,4 А). Плоскости остатков оснований перпендикулярны длинной оси спирали. Плоскости углеводных остатков несколько отклоняются от этой оси (первоначально Уотсон и .Крик предположили, что они параллельны ей).

Из рисунка видно, что углеводофосфатный остов молекулы обращен наружу. Спираль закручена таким образом, что на ее поверхности можно выделить две различные по размерам бороздки (их часто называют также желобками) — большую, шириной примерно 2,2 нм (22 А), и малую —шириной около 1,2 нм (12А). Спираль — правовращающая. Полидезоксирибонуклеотидные цепи в ней антипараллельны: это означает, что если мы будем двигаться вдоль длинной оси спирали от одного ее конца к другому, то в одной цепи мы будем проходить фосфодиэфирные связи в направлении 3'а 5', а в другой — в направлении 5'а 3'. Иными словами, на каждом из концов линейной молекулы ДНК расположены 5'-конец одной и 3'-конец другой цепи.

Регулярность спирали требует, чтобы против остатка пуринового основания в одной цепи находился остаток пиримидинового основания в другой цепи. Как уже подчеркивалось, это требование реализуется в виде принципа образования комплементарных пар оснований, т. е. остаткам аденина и гуанина в одной цепи соответствуют остатки тимина и цитозина в другой цепи (и наоборот).

Таким образом, последовательность нуклеотидов в одной цепи молекулы ДНК предопределяет нуклеотидную последовательность другой цепи.

Этот принцип является главным следствием модели Уотсона и Крика, поскольку он в удивительно простых химических терминах объясняет основное функциональное назначение ДНК — быть хранителем генетической информации.

Заканчивая рассмотрение модели Уотсона и Крика, остается добавить, что соседние пары остатков оснований в ДНК, находящейся в В-форме, повернуты друг относительно друга на 36° (угол между прямыми, соединяющими атомы С 1 ' в соседних комплементарных парах).

3. Выделение дезоксирибонуклеиновых кислот

Живые клетки, за исключением сперматозоидов, в норме содержат значительно больше рибонуклеиновой, чем дезоксирибонуклеиновой кислоты. На методы выделения дезоксирибонуклеиновых кислот оказало большое влияние то обстоятельство, что, тогда как рибонуклеопротеиды и рибонуклеиновые кислоты растворимы в разбавленном (0,15 М) растворе хлористого натрия, дезоксирибонуклеопротеидные комплексы фактически в нем нерастворимы. Поэтому гомогенизированный орган или организм тщательно промывают разбавленным солевым раствором, из остатка с помощью крепкого солевого раствора экстрагируют дезоксирибонуклеиновую кислоту, которую осаждают затем добавлением этанола. С другой стороны, элюирование того же остатка водой дает раствор, из которого при добавлении соли выпадает дезоксирибонуклеопротеид. Расщепление нуклеопротеида, который в основном представляет собой солеподобный комплекс между полиосновными и поликислотными электролитами, легко достигается растворением в крепком солевом растворе или обработкой тиоцианатом калия. Большую часть белка можно удалить либо добавлением этанола, либо эмульгированием с помощью хлороформа и амилового или октилового спирта (белок образует с хлороформом гель). Широко применялась также обработка детергентами. Позднее дезоксирибонуклеиновые кислоты выделяли с помощью экстракции водными n-аминосалицилат — фенольными растворами. При использовании этого метода были получены препараты дезоксирибонуклеиновой кислоты, из которых одни содержали остаточный белок, тогда как другие были фактически свободны от белка, что указывает на то, что характер связи белок — нуклеиновая кислота различен в различных тканях. Удобная модификация состоит в гомогенизировании животной ткани в 0,15 М растворе фенолфталеиндифосфата с последующим добавлением фенола для осаждения ДНК (свободной от РНК) с хорошим выходом.

Дезоксирибонуклеиновые кислоты, каким бы способом они не выделялись, представляют собой смеси полимеров различного молекулярного веса, за исключением образцов, полученных из некоторых видов бактериофагов.

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ

Ранний метод разделения заключался в фракционной диссоциации гелей дезоксирибонуклеопротеида (например, нуклеогистона) посредством экстракции водными растворами хлористого натрия увеличивающейся молярности. Таким путем препараты дезоксирибонуклеиновой кислоты были разделены на ряд фракций, характеризующихся различным отношением содержания аденина с тимином к сумме гуанина с цитозином, причем более легко выделялись фракции, обогащенные гуанином и цитозином. Сходные результаты были получены при хроматографическом отделении дезоксирибонуклеиновой кислоты от гистона, адсорбированного на кизельгуре, с применением градиентного элюирования растворами хлористого натрия. В улучшенном варианте этого метода очищенные фракции гистона сочетались с n-аминобензилцеллюлозой с образованием диазомостиков от тирозиновых и гистидиновых групп белка. Описано также фракционирование нуклеиновых кислот на метилированном сывороточном альбумине (с кизельгуром в качестве носителя). Скорость элюирования с колонки солевыми растворами увеличивающейся концентрации зависит от молекулярного веса, состава (нуклеиновые кислоты с высоким содержанием гуанина с цитозином элюируются легче) и вторичной структуры (денатурированная ДНК прочнее удерживается колонкой, чем нативная). Таким способом из ДНК морского краба Cancer borealis выделен природный компонент — полидезоксиадениловая-тимидиловая кислота. Фракционирование дезоксирибонуклеиновых кислот проводилось также посредством градиентного элюирования с колонки, наполненной фосфатом кальция.

4. Выделение рибонуклеиновых кислот

Методы, используемые для экстракции рибонуклеиновых кислот, частично зависят от природы органа или организма. В одном из ранних методов, использованном Левиным, к густому тесту из дрожжей добавляли щелочь, смесь перемешивали с пикриновой кислотой, фильтровали и нуклеиновую кислоту осаждали из фильтрата добавлением соляной кислоты. Такая довольно жесткая обработка приводила к тому, что полученная нуклеиновая кислота значительно отличалась от “нативной” рибонуклеиновой кислоты. Для выделения рибонуклеиновых кислот, приближающихся по структуре к нуклеиновым кислотам живой клетки, необходимо избегать применения жестких условий (рН, температура) в то же время необходимо, насколько возможно, затормозить ферментативный распад. Широко применялась экстракция рибонуклеопротеидов изотоническим раствором хлористого натрия. Белки от нуклеиновых кислот могут быть отщеплены различными методами, такими, как обработка смесями хлороформа с октиловым спиртом, додецилсульфатом натрия, нитратом стронция или спиртом, а также расщепление белковой фракции трипсином. И снова эффективность каждого метода определяется природой рибонуклеопротеида. Для инактивации ферментов в процессе экстракции полезно применение хлоргидрата гуанидина (денатурирующего агента); для выделения рибонуклеиновых кислот и нативных рибонуклеопротеидов из дрожжей был применен метод, использующий адсорбцию рибонуклеаз на бентоните после предварительной обработки ионами цинка.