Амилаза ржаной муки. Строение и функции

В отличие от -амилазы, -амилаза практически не гидролизует нативный крахмал, тогда как клейстеризованный крахмал гидро­лизуется ею с образованием мальтозы -конфигурации. Если гидролизу подвергается амилоза, то гидролиз идет полностью до мальтозы. Не­значительное количество декстринов может образовы­ваться при гидролизе «ано­мальных»  амилоз, так как гидролиз -амилазой идет только по линейной цепи до -1,6-связей. Если субстратом для -амилазы служит амилопектин, то гидролиз идет в значительно меньшей степени [3].

Схематично расщепление амилозы и амилопектина β-амилазой представлено на рис.3.[5] ,и в этом случае для большей наглядности представлены линейные α-1,4-глюкановые цепи амилозы и разветвленные α-1.4(1,6)- глюкановые цепи амилопектина.

.

Рис.3. Действие β-амилазы на крахмал

-Амилаза отщепляет фрагмент с не­редуцирующего конца участка от внешних линейных ветвей, имеющих по 20-26 глюкозных остатков, с образованием 10—12 молекул мальтозы. Гид­ролиз приостанавливается на предпоследней -1,4-связи, граничащей с -1,6-связью. В гидролизате накапливается 54-58% мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные декстрины, содержащие значи­тельное количество а-1,6-связей - так называемые -декстрины. Действие -амилазы на крахмал можно записать в виде следующей схемы [5]:

                 -Амилаза

Крахмал = Мальтоза + β-Декстрин

гликоген    (54-58%)       (42-46%)

1.2.4 Активность амилаз в ржаной муки

Хлебопекарные свойства ржаной муки определяются состоянием ее углеродно-амилазного комплекса. Амилазы  гидролизуют крахмал в процессе брожения теста, в следствие чего тестовая заготовка может оказаться неспособной связ0ать влагу в тесте. Наличие большого количества α-амилаз приводит к накоплению значительного количества декстринов, неблагоприятно воздействующих на органолептические свойства готового хлеба.

Поэтому очень важно знать автолитическую активность муки, которая показывает активность амилаз Слишком высокая и слишком низкая автолитическая активность отрицательно влияют на качество хлеба. Для того чтобы регулировать автолитические процессы в производстве хлеба, необходимо знать свойства важнейших ферментов муки, действующих на белки, крахмал и другие компоненты муки.

β-Амилаза способствует накоплению сахаров, необходимых для спиртового брожения в тесте, а α-амилаза, превращая крахмал в декстрины, ухудшает качество хлебных изделий. По сравнению с крахмалом декстрины плохо набухают в воде. В ржаной муке нормального качества всегда содержится α-амилаза, что значительно влияет на ее хлебопекарные свойства.

Термостабильность амилазы определяется степенью спелости зерна и относится главным образом к зерну полной спелости. Лучшим источником ферментов являются пророщенные семена зерновых культур, в которых в процессе солодоращения достигнут высокий уровень активности α-амилазы.

1.3. Применение амилаз в промышленных технологиях

Амилазы очень широко распространены в природе. Они синтезируются многими микроорганизмами (бактерии, грибы, актиномицеты, дрожжи), животными и растениями. До развития ферментной промышленности глав­ным промышленным источником получения амилаз в европейских странах было проросшее зерно (солод). Для медицинских целей амилазы получали из животного сырья. В настоящее время главным источником амилаз явля­ются микроорганизмы, особенно бактерии, грибы и реже дрожжи.

Применяются амилазы в различных отраслях[5,11,13]:

     Хлебопечение и кондитерская промышленность: добавление амилазы резко улучшается вкус, аромат, окраска корки, увеличивается удельный объем, пористость, содержание сахара, улучшается вся структура хлеба, а также режим тестоведения и ход производства в целом. Эти изменения происходят потому, что фермент, расщепив крахмал, увеличивает содержание сахара в муке.

     Спиртовая промышленность: ранее источником сырья был солод, но в последнее время доказано что осахаривающая амилаза грибов наиболее эффективна. Это позволяет: 1) высвободить десятки тонн высококачественного зерна; 2)повысить выход спирта; 3)резко сократить время получения ферментного препарата; 4)уменьшить количество производственных площадей, а также расход весьма тяжелого труда и всех видов энергии;

     Пивоварение: амилазы используются как замена зернового солода;

     При производстве различных изделий из крупяных продуктов;

     В производстве овощепродуктов: овощи могут быстро развариваться, и высушиваться, разжижаться, что дает преимущества при их использовании;

     При производстве детской пищи: амилаза значительно облегчает переваривание и усваивание продуктов организмом ребенка; также улучшает вкусовые свойства, что для детей также важно;

     В текстильном производстве : амилазы используются для расшлихтовки растительного волокна перед отбеливанием и крашением;

     В бумажной  промышленности: с помощью амилаз получают специальный крахмал, который добавляют при проклейки бумаги, что придает ей упругость, плотность, прочность, глянец;

     В промышленности очистки: с помощью амилаз приготавливают специальный растворимый крахмал, который используют для подкрахмаливания белья;

     В медицине: как средство, улучшающее пищеварение, в частности при диспепсии, гастрите и других расстройствах желудочно-кишечного тракта

2. Экспериментальная часть

Количественное определение активности амилаз ржаной муки

Цель: количественно определить активность амилаз ржаной муки колориметрическим методом с помощью качественной реакции на крахмал с раствором Люголя.

2.1.1. Материалы и реактивы.

1.Мука пшеничная хлебопекарная. Высший сорт. ГОСТ Р52189 – 2003.

Производитель: г. Барнаул, ООО «Мария – РА».

Название: «Мария».

Дата выработки: 15. 07. 09 г.

Время хранения – 3 месяца.

2.Мука пшеничная хлебопекарная. Сорт высший. ГОСТ Р52189 – 2003.

Производитель: Литва,г..Вилсен,.ЗАО «Малсена плюс».

Название: «Литовская».

Дата выработки: 16. 06. 09г.

Время хранения: 4 месяца.

2.1.2. Оборудование.

1.      колбы конические на 50 мл

2.      колбы мерные на 50 мл

3.      пипетки, градуированные на 1 мл

4.      пипетки с одной меткой для прямого слива на 1 и 2 мл

5.      пробирки на 10 мл

6.      фотоколориметр

7.      термостат

8.      баня водяная

9.      холодильник

10. центрифуга

11. весы лабораторные электронные

2.2.Методика исследования [6]:

Выделение ферментного препарата.

1.      Взвесить 3 г муки с записью до второго знака, поместить в фарфоровую ступку и растереть с небольшим количеством битого стекла, приливая по частям 15 мл 1% раствора хлорида натрия, до однородной массы.

2.      Однородную массу перенести в стакан, затем для выделения белков поставить в холодильник на 1-1,5 ч, перемешивая раствор палочкой через каждые 15-20 мин.

3.      После выделения белков раствор перенести в центрифужные пробирки и центрифугировать 10 мин при 4000-5000 об/мин.

4.      Прозрачную надосадочную жидкость из пробирок слить в коническую колбу и использовать в качестве ферментного препарата для определения активности амилаз.

Определение суммарной активности амилаз.

1.      В две пробирки налить по 3 мл 0,2н ацетатного буфера (рН=5,5) и по 3 мл 2% раствора крахмала, затем нагреть на водяной бане до 40оС.

2.      В одну пробирку прилить 1 мл ферментного препарата (опыт), в другую – 1 мл воды (контроль).

3.      Содержимое пробирок перемешать и поставить в термостат при 40оСна 30 мин. За это время крахмал под действием амлаз гидролиз0уется до мальтозы. В каждую пробирку внести по 2 мл 1н раствора соляной кислоты для инактивации фермента.

4.      Из каждой пробирки отобрать пипеткой по 0,5 мл смеси и поместить в мерные колбы на 50 мл, в которые перед этим налито по 30-40 мл воды, 1 мл 0,1н раствора соляной кислоты, 5 капель 0,3% раствора йода в 3% растворе йодата калия. Объем раствора в каждой колбе довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать, интенсивность окраски измерить на фотоэлкетроколориметре при красном светофильтре (λ=590 нм).

5.      Вычислить амилолитическую способность ферментного препарата по формуле:

АС=2С(Еk – Ео)/ Еk,

где АС – амилолитическая способность 1 мл ферментного прнепарата за 1 ч/г;

Еk – оптическая плотность контрольного раствора;

Ео – оптическая плотность исследуемого раствора;

С – количество внесенного крахмала в г (0,06);

2 – коэффициент пересчета АС для времени инкубации 1 ч.

Определение α- и β-амилазы.

1.      В оставшуюся часть (5-8 мл) ферментного препарата добавить на кончике шпателя сухого уксуснокислого кальция и поставить в водяную баню при 70она 15 мин, затем быстро охладить. β-амилаза при таких условиях инактивируется практически полностью.

2.      Раствор использовать для определения α-амилазной активности по вышеописанной методике.

3.      Активность β-амилазы определяют по разности между суммарной активностью амилаз и активностью α-амилазы

2.3. Результаты представлены в таблице № 12

Таблица № 12 Измерение оптической плотности опытного и контрольного раствора амилазы ржаной муки, %

Из таблицы 12 видно, что оптическая плотность α-амилазы меньше оптической плотности β-амилазы. Это говорит о том, что в ржаной муке количество β-амилаз превышает количество α-амилазы.

Таблица № 13 Расчет амилолитической способности α- и β-амилазы ржаной муки, мг/ч