Получение промышленных штаммов микроорганизмов

Биотехнология в сельском хозяйстве

Энтомопатогенные  препараты на основе бактерий

Препараты, производимые для сельского хозяйства, делятся  на 3 группы:

• энтомопатогенные препараты;
• бактериальные удобрения;
• антибиотики

Энтомопатогенные  препараты

Отечественное биотехнологическое производство выпускает 3 группы энтомопатогенных препаратов:

• 1. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis - энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин.
• 2. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana.
• 3. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдра (вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и др.).

Все микробные  патогены выпускаются в виде смачивающих  порошков, паст, реже - гранул, эмульсии спор и кристаллов. При непосредственном применении предполагается использование различных добавок в виде растворителей, прилипателей, способствующих повышению их эффективности. Технология получения бактериальных энтомопатогенных препаратов Наибольшее распространение среди промышленно выпускаемых микробных патогенов получили бактериальные препараты. Их отличительными особенностями являются высокая вирулентность по отношению к насекомым-вредителям, безопасность для окружающей флоры и фауны, достаточно высокая скорость воздействия на вредителей и др. В настоящее время производятся препараты против более 160 видов насекомых.

Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее исследованы грамположительные  бактерии Bac.thuringiensis. Она не только разрушает  насекомое, попадая внутрь, но и продуцирует  ряд токсичных продуктов. Среди  этих токсичных продуктов выделяют 4 компонента:

- α-экзотоксин, или фосфолипаза С, - продукт растущих  клеток бактерий. Токсическое действие  фермента связывают с индуцируемым  им распадом незаменимых фосфолипидов  в ткани насекомого, что приводит  к гибели последнего.

- β-экзотоксин - накапливается в культуральной  жидкости при росте клеток. Считают,  что молекула β-токсина состоит  из нуклеотида, связанного через  рибозу и глюкозу с аллослизевой  кислотой. Его действие, видимо, обусловлено  ингибированием нуклеотидазы и  ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанных с АТФ, что приводит к прекращению синтеза РНК. По сравнению с другими токсинами действует медленнее, в основном при переходе от одного цикла развития к другому. По наблюдениям, β-экзотоксин - мутаген, поражающий генетический аппарат особей.

- γ-экзотоксин - малоизученный компонент, неидентифицированный  фермент (или группа ферментов).

- δ-эндотоксин - параспоральный кристаллический  эндотоксин. Образуется в процессе  споруляции бактерии в противоположной  от формирующейся споры части бактерии. На завершающей стадии спорообразования токсин приобретает форму 8-гранного кристалла. Кристаллы состоят из белка, аминокислотный состав которого близок для различных штаммов. Доказано, что кристаллический белок в кишечнике восприимчивых насекомых распадается на молекулы протоксина. Протоксин под действием протеиназ распадается на токсические фрагменты. Различие в восприимчивости некоторых видов насекомых к действию кристалла, по-видимому, связано с присутствием специальных кишечных протеаз, осуществляющих гидролиз кристаллов in vivo. Такими протеазами обладают не все насекомые, отсюда и избирательность действия δ-токсина. Чтобы насекомое погибло, кристаллы должны попасть в его организм. После поглощения кристаллов гусеницы перестают питаться. Первичным местом действия δ-токсина является средний отдел кишечника.

В зависимости  от реакции на кристаллы насекомые  делятся на три группы:

• характерен общий паралич;
• паралич среднего отдела кишечника;
• реакция на препарат в целом: гибель в результате прорастания спор и последующего размножения бактерий.

Бактерии Bac. thuringiensis антагонистичны к 130 видам насекомых. Наибольший эффект достигается при  применении препаратов этой группы против листогрызущих вредителей. Наиболее распространенные препараты на основе различных вариаций Bac. thuringiensis: энтобактерин, инсектин, алестин, экзотоксин, токсобактерин, дендробациллин, битоксибациллин.

Промышленное  производство энтомопатогенных бактерий заключается в глубоком культивировании. При этом ставится задача получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсина. Требования к промышленным штаммам энтомопатогенных бактерий: принадлежность штамма к определенному серотипу, высокая вирулентность и продуктивность на промышленных средах, устойчивость к комплексу фагов и т.д. Технология производства включает все стадии, типичные для любого биотехнологического производства. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной (28-30^оС), продолжительность ферментации составляет 35-40 часов. Используют дрожже-полисахаридную среду, содержащую в процентах: кормовые дрожжи - 2-3; кукурузную муку - 1-1.5; кашалотовый жир - 1. Перед началом культивирования рН составляет около 6.3, к концу ферментации - повышается до 8.0 - 8.5, что может привести к разрушению кристаллов на более мелкие фрагменты и затруднить их выделение. Чтобы предотвратить это, культуральную жидкость перед переработкой подкисляют до 6.0 - 6.2. Культивирование заканчивают при степени споруляции 90-95% и титре спор не менее 10⁹ в 1 мл. После сепарации культуральной жидкости получают пасту влажностью 85% с выходом около 100 кг в 1 кубометре культуральной жидкости и титром порядка 20*10⁹ спор в 1 грамме. Фугат можно употребить для приготовления питательной среды, но не более 1-2 раз, так как в культуральной жидкости накапливаются вещества, ингибирующие развитие культуры. Фугат находит свое применение в качестве сырья при производстве кормовых дрожжей, что обеспечивает сокращение промышленных стоков и снижает расход воды. Пасту перемешивают в течение получаса для однородного распределения спор и кристаллов и отбирают пробы на проверку титра, влажности, вирулентности, наличия фага.

Конечный продукт - смачивающий порошок или стабилизированная  паста. Первый получают путем высушивания увлажненной пасты на распылительной сушке. Готовый препарат фасуют по 20 кг в четырехслойные крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем. Вторую - внесением в пату КМЦ. При смешении молекулы КМЦ сорбируют белковые кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует равномерному распределению активного начала по всему объёму и увеличению срока хранения. Готовый препарат - вязкая жидкость кремового или светло-серого цвета, без запаха, не замерзающую при хранении. Препарат предназначен для борьбы с садово-огородными вредителями, эффективен против 60 видов насекомых. Применяют путем опрыскивания растений водной эмульсией в период активного роста вредителя. Основная масса вредителей погибает в течение 2-10 дней. На 1 га расходуют: для овощных культур 1-3 кг, садовых - 3-5 кг.

Тема 2

Биотехнология в сельском хозяйстве

Кормовые  антибиотики, антибиотики  против фитопатогенов, биостимуляторы, пищевые  консерванты

Антибиотики применяют  в нескольких целях:

• для борьбы с болезнями животных;
• для борьбы с болезнями растений;
• как стимуляторы роста животных;
• при консервировании продуктов;
• в научных исследованиях (в области биохимии, молекулярной биологии, генетике, онкологии).

Современное определение  термина "антибиотик" принадлежит  М.М.Шемякину и А.С.Хохлову (1961), которые предложили считать антибиотическими веществами все продукты обмена любых организмов, способные избирательно убивать или подавлять рост и развитие микроорганизмов.

Полная химическая структура установлена только для  трети антибиотиков, а может быть получена химическим путем лишь половина из них. Синтез микроорганизмами антибиотиков - одна из форм проявления антагонизма, связан с определенным характером обмена веществ, возникшим и закрепленным в ходе эволюции. Воздействуя на постороннюю микробную клетку, антибиотик вызывает нарушения в её развитии. Некоторые антибиотики способны подавлять синтез оболочки бактериальной клетки в период размножения, другие изменяют проницаемость цитоплазматической мембраны, некоторые ингибируют реакции обмена веществ. Механизм действия антибиотиков выявлен не полностью.

В течение многих лет антибиотики используют как  стимуляторы роста сельскохозяйственных животных и птицы, как средства борьбы с заболеваниями растений и посторонней  микрофлорой в ряде бродильных производств, как консерванты пищевых продуктов. Механизм стимулирующего действия антибиотиков также не до конца выяснен. Предполагают, что стимулирующий эффект низких концентраций антибиотиков на организм животного связан с двумя факторами:

• воздействие на микрофлору кишечника,
• непосредственное влияние на организм животного.

В первом случае антибиотики снижают число вредных  и увеличивают количество полезных для организма микроорганизмов. Во втором случае - снижают рН содержимого  кишечника, уменьшают поверхностное натяжение клеток организма, что способствует ускорению их деления. Кроме того, антибиотики увеличивают количество ростовых гормонов, приспособляемость организма к неблагоприятным условиям и т.д. Кормовые антибиотики применяют в виде неочищенных препаратов, представляющих собой высушенную массу продуцента, содержащую помимо антибиотика аминокислоты, ферменты, витамина группы В и другие биологически активные вещества.

Все производимые кормовые антибиотики:

• не используются в терапевтических целях и не вызывают перекрестной резистентности бактерий к антибиотикам, применяемым в медицине;
• практически не всасываются в кровь из пищеварительного тракта;
• не меняют своей структуры в организме;
• не обладают антигенной природой, способствующей возникновению аллергии.

В настоящее  время выпускаются несколько  видов кормовых антибиотиков: препараты  на основе хлортетрациклина (биовит, кормовой биомицин), бацитрацин, гризин, гигромицин Б и др. Из этих препаратов только бацитрацин представляет собой высушенную культуральную жидкость, полученную в результате глубинного выращивания Bacilus licheniformis. Остальные антибиотики являются продуктами жизнедеятельности разных видов Actinomyces.

Антибиотики используют и как средство борьбы с различными фитопатогенами. Воздействие антибиотика сводится к замедлению роста и гибели фитопатогенных микроорганизмов, содержащихся в семенах и вегетативных органах растений. К таким антибиотикам относятся фитобактериомицин, трихотецин, полимицин.

Применение антибиотиков в пищевой промышленности позволяет снизить длительность термообработки продуктов питания при их консервировании. Используемые антибиотики воздействуют на клостридиальные и термофильные бактерии, устойчивые к нагреванию. Наиболее эффективным признан низин, который практически не токсичен для человека и позволяет вдвое снизить время термообработки.

В заключение хотелось бы отметить, что в настоящем пособии  не рассмотрены промышленные производства всех веществ, получаемых с помощью  биотехнологии. Однако получить представление  об основных принципах организации и осуществления биотехнологических процессов при производстве первичных и вторичных метаболитов, а также жизнеспособных микроорганизмов можно, думается, и из приведенного выше материала. Кроме того, рассмотренные примеры могут быть использованы в той или иной форме при изложении материала на уроках биологии.

Тема 5

Сельское хозяйство  является важной отраслью экономики  любого государства. Давно известно, что крепкая экономика страны напрямую зависит от обеспечения  независимости от других стран, особенно в сфере обеспечения людей продуктами питания. Сельское хозяйство позволяет в полной мере решить эту проблему. В нашей стране много земли, но климат достаточно суров, поэтому без инновационного подхода очень сложно получать хорошие результаты. Одной из приоритетных задач на сегодняшний день является разработка и внедрение современных достижений биотехнологии для повышения доходности сельского хозяйства. Научный подход помогает решить множество проблем и повысить эффективность этой отрасли. 
 
Одной из главных проблем любой фермы на сегодняшний день является утилизация отходов. Ведь чем больше поголовье скота и птицы, тем больше отходов получается в итоге. В день животные производят несколько килограммов экскрементов и десятки литров мочи, которые могут наносить вред окружающей среде, подземным водам и к тому же создавать неприятный запах. Для хранения отходов свинофермы, скотного двора или птичника требуется создание огромных резервуаров для хранения продуктов жизнедеятельности животных и птиц, а если их численность исчисляется тысячами, то размеры таких резервуаров должны быть просто огромными. Еще необходимо построить очистные сооружения, а для их создания требуются большие финансовые затраты. 
 
Обычно продукты жизнедеятельности животных в сельском хозяйстве принято использовать в качестве удобрений, но вносят их в почву лишь раз в год, да и к тому же не всегда экскременты бывают пригодны для этих целей в чистом виде. Особенно остро данная проблема встает во время эпидемий скота, когда экскременты животных могут представлять угрозу для людей и других животных, поэтому требуют обеззараживания. Для этих целей на сельскохозяйственных предприятиях во всем мире все чаще стали использовать специальные установки для утилизации органических отходов, созданные на основе биотехнологий. Такие установки позволяют за короткие сроки перерабатывать большое количество отходов и получать в результате качественное удобрение и биотопливо. 
 
Даже небольшая установка может решить проблемы утилизации отходов фермы и обеспечить ее дешевым топливом. После того, как экскременты животных помещают в герметичный резервуар установки для утилизации органических отходов, в ней начинается процесс сбраживания, который в условиях отсутствия кислорода и дополнительного подогрева проходит достаточно быстро. В результате на выходе получается качественное экологически чистое удобрение и биогаз. Биогаз, произведенный таким способом, можно использовать как и обычный природный газ, поскольку в нем содержится метан. 
Процесс брожения проходит при повышенной температуре, поэтому продукты жизнедеятельности животных обеззараживаются, а в полученном удобрении семена сорных трав утрачивают способность к прорастанию, что повышает эффективность удобрения в несколько раз и снижает необходимость обработки почвы гербицидами. Такое удобрение можно не только использовать для собственных нужд, но и продавать хозяйствам, которые занимаются выращиванием сельхозкультур. 
 
Затраты на установку могут быть гораздо ниже, чем на строительство резервуаров для хранения отходов, к тому же она занимает меньше места. Самый главный плюс такого технического устройства в том, что с годами оно полностью окупится, и будет приносить прибыль. Биогаз, вырабатываемый установкой, можно использовать для обогрева помещений и получения горячей воды, для работы газового оборудования и освещения территории, что еще раз доказывает огромную пользу биотехнологий для сельского хозяйства.