Производство витамина В2

Рибофлавин (витамин В₂)  

• Рибофлавин, или витамин В2 - содержится в клетках различных микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопротеинов (прежде всего - соответствующих ферментов из класса оксидоредуктаз - ФМН, ФАД). Поэтому в качестве продуцентов рибофлавина (флавопротеинов) могут быть бактерии, дрожжи и нитчатые грибы. Однако наиболее заманчивыми являются те штаммы, которые образуют на жидких средах 0,5 г и более рибофлавина в 1 л среды. К подобным организмам относятся Ashbyii gossypii, Eremothecium ashbyii и Candida guilliermondii.

• Методами  генной инженерии удалось получить штамм сенной палочки, образующий около 6 г рибофлавина в

   1 л  среды, включающей мелассу, белково-витаминный  концентрат и его гидролизат.

В качестве источников углерода применяют глюкозу или  сахарозу, практикуют использование  дрожжевого и кукурузного экстрактов, соевой муки, масла (жира).  
 

• Жидкие  питательные среды для получения  инокулята и для основной ферментации могут несколько различаться между собой.

   Например, для получения посевного материала известна среда, содержащая сахарозу, пептон, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, магния сульфат, подсолнечное масло, время выращивания продуцента на этой среде - 2 суток при 27-30*С (в зависимости от штамма).

   Ферментационная  среда обычно включает кукурузную и соевую муку, сахарозу, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, кальция карбонат, натрия хлорид и ненасыщенный жир.  

Обычно ферментацию  проводят в течение 5 суток при  рН 5,5- 7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 часов) начинает заметно накапливаться витамин В2, вначале - в мицелии, а затем - в культуральной жидкости. Всю биомассу можно подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточной влажностью 8%, содержащий 1,5-2,5% рибофлавина, 20% белка, тиамин, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества, рекомендуют для кормления животных.

• Рибофлавин  функционирует в коэнзимных формах, представляющих собой его фосфорные эфиры: флавиномононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). В последние десятилетия открыты новые биокаталитические факторы изоаллоксазиновой структуры, функциональные группы которых представлены модифицированными молекулами РФ, ФМН, ФАД.

• Продуцентами  рибофлавина в природе являются высшие растения, дрожжи, мицелиальные грибы и бактерии. Большинство микроорганизмов образует свободный рибофлавин и две его коферментные формы –   ФМН и ФАД. Из многих бактерий и плесневых грибов выделены аналоги РФ и их коферментные формы. Изучение особенностей биосинтеза РФ различными группами микроорганизмов показало, что он, как правило, образуется в больших количествах, чем нужно для удовлетворения потребности клетки в этом витамине. Среди прокариот флавиногенной группой считают микобактерии и ацетонобутиловые бактерии. Из актиномицетов значительные количества РФ синтезируют Nocardiae ritropolis. Среди плесневых грибов наиболее активные продуценты рибофлавина – грибы рода Aspergillus (Asp. niger).Активные продуценты рибофлавина Eremothecium ashbyii, Ashbyii gossypii 

 

Продуценты  рибофлавина  

• Путь  синтеза рибофлавина установлен в результате исследований, выполненных с грибом   Eremothecium ashbyii, на мутантах Saccharomyces cerevisiae, Pichiaguillier mondii и мутантах бактерий Вас. subtilis. Расшифровке пути способствовали исследования с мечеными соединениями и осуществление ранних реакций биосинтеза invitro. Предшественником РФ служит гуанозинтрифосфат (ГТФ). Пуриновое кольцо ГТФ локализуется в гетероциклическом ядре РФ, а рибозное ядро включается в рибитильную цепь РФ.  

• Кормовой  концентрат РФ получают с помощью  гриба Eremothecium ashbyii. Недостаток культуры Е. Ashbyii – ее нестабильность

 

Получение и применение рибофлавина  

• При хранении на твердых средах при комнатной, низкой температуре и даже в процессе лиофилизации гриб легко теряет способность  к сверх синтезу РФ. Для сохранения штамма Е. ashbyii в активном состоянии в течение длительного времени (8-10 месяцев) рекомендуется производить систематический рассев на твердые питательные среды и отбирать наиболее интенсивно окрашенные в оранжевый цвет колонии. Яркая окраска колоний коррелирует с высокой рибофлавин-синтетической способностью.

• Среда для  пробирок содержит соевую муку, свекловичный сахар, агар, рН 6,8 (1-й вариант) или дрожжевой экстракт, пептон, глюкозу, агар, рН 6,8 (2-й вариант). Время выращивания 5-7 сут. Среда для колб и бутылей содержит: соевую муку, свекловичный сахар (1-й вариант) или пептон, свекловичный сахар, кукурузный экстракт, KH₂P0₄, MgS0₄, подсолнечное масло (2-й вариант). Время выращивания 48 ч. Среда в инокуляторе содержит кукурузный экстракт, свекловичный сахар, КН₂Р0₄, технический жир.

• Технологическая схема получения кормового препарата рибофлавина представлена на рисунке. В инокуляторе 8 культуру выращивают в течение 21-26 ч, затем переводят ее в ферментер 7 с питательной средой, содержащей: кукурузную муку, соевую муку, кукурузный экстракт, свекловичный сахар, КН₂РО₄, СаСО₃, NaСI и технический жир. Среду стерилизуют в смесителе 6 при 120-122°С в течение часа. Культивирование в ферментере ведут до начала лизиса клеток и появления спор (определяют микроскопически).

  Температура культивирования 28-30°С, давление воздуха в ферментере (1-2)*10⁴ Па, расход воздуха 1,5-2,0 л в минуту на 1 л культуральной жидкости. Выход РФ около 1200 мкг/мл.

  Для получения кормового препарата РФ культуральную жидкостькость упаривают под вакуумом 10 до содержания 30-40%. Сироп высушивают в распылительной сушилке 11, сухую пленку дробят в дробилке 12 до состояния порошка, который расфасовывают.

• В медицине применяют витамин В₂ в виде витаминных препаратов при недостаточном содержании его в рационе, а также путем инъекций ФМН и ФАД при патологических явлениях, связанных с нарушением обмена флавиновых нуклеотидов. ФМН и ФАД (флавинат) применяют при лечении дистрофии сетчатки глаза, а также при заболеваниях печени и поджелудочной железы.

Спасибо за внимание!!!