Определение афлатоксинов, в частности М1, в молочных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

    В Европе допустимы крайне низкие содержания в молоке для  кормления  грудных  детей (0,25мкг/л) или  в  детском  питании,  содержащем  молоко (0,5 мкг/л). В соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 для молока и молочных продуктов установлена предельно допустимая концентрация афлатоксина М1 на уровне 0,5 мкг/л. 
 
 
 
 
 

2. Теоретические основы высокоэффективной  жидкостной хроматографии

       Хроматография – физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. Хроматографический анализ является критерием однородности вещества. Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси можно идентифицировать (установить природу) и количественно определять (массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-химическими методами. Главной задачей хроматографии является разделение веществ. [4]

       Основными элементами хроматографического метода анализа являются неподвижная и  подвижная фазы. Неподвижная фаза – это пористый сорбент, который удерживается в колонке фильтрами. Для ВЭЖХ используются сорбенты с частицами малого размера (1,8 – 5 мкм) и неоднородной поверхностью. Это позволяет увеличить скорость сорбции и десорбции подвижной фазы, а в итоге – сократить время проведения хроматографического анализа. Подвижная фаза – это растворитель, который перемещается относительно сорбента. В верхнюю часть колонки вводятся анализируемые соединения, которые называются сорбатами. При движении вдоль колонки сорбаты диффундируют внутрь пор сорбента и в результате межмолекулярных взаимодействий адсорбируются на поверхности неподвижной фазы. Доля времени, в течение которого молекулы находятся в адсорбированном состоянии, определяется силой межмолекулярного воздействия сорбатов с сорбентом. При очень слабой адсорбции молекулы почти все время проводят в растворе подвижной фазы и поэтому перемещаются вниз по колонке со скоростью, лишь незначительно уступающей скорости движения подвижной фазы. При очень сильной адсорбции молекулы сорбата почти не отрываются от поверхности и скорость их перемещения вниз по колонке крайне незначительна. Для получения достоверных анализов добиваются скорости перемещения молекул сорбата по колонке в 2-10 раз меньше скорости движения подвижной фазы. Явление замедленного движения молекул сорбата относительно движения молекул подвижной фазы называется удерживанием. Время удерживания является одной из характеристик вещества, с помощью которого можно произвести его качественное определение по атласу хроматограмм. Из-за различия времени удерживания различных веществ будет различаться и время их выхода из колонки. Таким образом будет достигнута основная цель хроматографии – разделение. [10]

       Но  скорости перемещения некоторых  молекул исследуемых веществ  отклоняются от средних значений скорости для данных веществ. Молекулы сорбатов, введённых в хроматографическую колонку в виде мгновенного импульса, выходят из неё более широкой зоной. Такая неидентичность скоростей перемещения одинаковых молекул в хроматографии называется размыванием. Это нежелательное явление при разделении веществ потому, что зоны различных анализируемых веществ могут наложиться одна на другую и разделение окажется неполным.  Поэтому метод анализа для их определения должен иметь высокую чувствительность и селективность. Особенно важны эти качества, например, для определения содержания афлатоксина М1 в молочных продуктах. [17]

       Одним из методов, который обеспечивает необходимую  степень чувствительности и селективности, является метод высокоэффективной  жидкостной хроматографии.  Кроме этого, употребление  метода  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии  дает  следующие преимущества:

       - высокая скорость процесса, позволившая  сократить продолжительность разделения  от нескольких часов и суток  до минут;

       - минимальная степень размывания хроматографических зон, что дало возможность разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по константам сорбции;

       - высокая степень механизации  и автоматизации разделения и  обработки информации;

• защита анализируемых веществ от воздействия дневного света;
• сниженный риск подверженности оператора воздействию афлатоксинов.

       ВЭЖХ  классифицируется по механизму сорбции:

       - адсорбционная хроматография –  молекулы сорбата связываются  с поверхностью твердого адсорбента  за счет дисперсионных, ориентационных, индукционных и донорно-акцепторных взаимодействий;

       - распределительная – молекулы  сорбата растворяются в жидкой  неподвижной фазе;

       - ионообменная (лигандообменная) –  между сорбатом и сорбентом  происходит обмен ионами (лигандами);

       - ситовая – сорбция отсутствует, а причиной разделения служит различная эффективная скорость диффузии молекул разных размеров внутрь пор неподвижной фазы. [15]

       По  сравнительной полярности подвижной  и неподвижной фаз:

       - нормально-фазовая хроматография  – такой вариант ВЭЖХ, когда подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная. Основным фактором, определяющим удерживание, является взаимодействие сорбатов непосредственно с поверхностью или объёмом сорбента;

        - обращено-фазовая – такой вариант  ВЭЖХ, когда подвижная фаза более полярна, чем неподвижная. Удерживание определяется непосредственным контактом молекул сорбата с поверхностью или объемом сорбента. При этом ионизированные сорбаты не обмениваются на ионы подвижной фазы, сорбированные на поверхности;

       - ионообменная хроматография – вариант, при котором сорбция осуществляется путём обмена сорбированных ионов подвижной фазы на ионы хроматографируемых веществ. Аналогично определяется лигандообенная хроматография;

       - хроматография на динамически  модифицированных сорбентах – вариант ВЭЖХ, при котором сорбат не взаимодействует непосредственно с поверхностью сорбента, а вступает в ассоциацию с молекулами приповерхностных слоев элюента;

       - ион-парная хроматография – такой  вариант обращено-фазовой хроматографии  ионизированных соединений, при котором в подвижную фазу добавляется гидрофобный противоион, качественно изменяющий сорбционные характеристики системы;

       - эксклюзивная хроматография –  способ разделения соединений  по их молекулярным массам, основанный  на различии в скорости диффузии в порах неподвижной фазы молекул различных размеров. [7]

       Процесс анализа пробы начинается с подготовки пробы. При работе с такими биологическими жидкостями, как, например, молоко, подготовка к анализу многостадийная. Она может включать операции по нагреванию, центрифугованию, осаждению и фильтрованию. Нагревание применяется для растворения слоя жира. Далее следует центрифугирование, чтобы разбить шарики жира на более мелкие. Такие шарики осаждаются быстрее и в большей мере, что позволяет повысить степень очистки пробы и в дальнейшем получить более точные результаты исследований. Пробу охлаждают для лучшего отделения жира. Верхний тонкий слой жира удаляют. Проводят фильтрование через один или более листов фильтровальной бумаги, если это необходимо. Таким образом удаётся максимально выделить из пробы вещества, которые представляют интерес для анализа. [1]

       Задача  разделения решается при помощи хроматографической колонки, которая представляет собой  трубку, заполненную сорбентом. При  проведении анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно отмеренную дозу пробы. Идентификация соединений осуществляется по их времени удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки. [9] 
 

       2. Аппаратура для ВЭЖХ 
 

       В современной жидкостной хроматографии  используют приборы различной степени  сложности - от наиболее простых систем до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами. Одним из таких является японский жидкостный хроматограф Jasco Expert (рис.3). Лучше всего он подходит для анализа афлатоксинов, микотоксинов и органических кислот. []

       Рис.3. Блок-схема жидкостного хроматографа Jasco Expert.

       1 - узел подготовки элюента; 2 - насос; 3 - инжектор; 4 - колонки для ВЭЖХ; 5 - термостат; 6 - детектор; 7 - регистрирующая система; 8 - программа сбора и обработки данных. 

       Подготовка  элюентов к работе проходит в узле подготовки элюента. Там происходит смешение и фильтрование рабочего элюента. После этого он поступает в насос. Насос предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется рабочим давлением в системе. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа применяют перистальтические насосы, но, так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы шприцевого или пистонного типов. В жидкостном хроматографе Jasco Expert используется плунжерный возвратно-поступательный насос Jasco PU 1580 с низким рабочим давлением (1,2 МПа) и скоростью потока 0,01-9,99 мл/мин. Принцип работы такого насоса состоит в том, что электромеханическое устройство приводит в возвратно-поступательное движение плунжер, перемещающийся в рабочей головке насоса. Клапаны открываются, когда насос находится в фазе всасывания и подачи соответственно. Величина объёмной подачи насоса определяется тремя параметрами: диаметром плунжера, его амплитудой и частотой. Насосы этого типа обеспечивают постоянную объёмную подачу подвижной фазы, во многих случаях они имеют возможность компенсировать сжимаемость растворителя.

       Инжектор  обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых  компонентов в колонку. В данном случае используется инжектор Rheodyne 7010A или Rheodyne 7725i. Инжектор Rheodyne 7725i - петлевой 6-ходовой инжектор с устройством шприцевого ввода образца, обеспечивающий ввод образца без прерывания потока. Оборудован устройством, выдающим сигнал при вводе образца. Инжекторы этой серии прилагаются к подавляющему большинству современных хроматографов.

       Колонки для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из стекла, которые способны выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Колонка включает в себя корпус, фильтры и наконечники. Корпус представляет собой цилиндрическую трубку из стекла. Он служит ёмкостью для слоя сорбента. Верхний и нижний концы корпуса закрывают фильтры. Чаще всего это диски из пористой нержавеющей стали, по диаметру соответствующие наружному диаметру колонки. Диаметр пор фильтров 0,5 – 2 мкм. Их назначение – удерживать слой сорбента в колонке. Фильтр на входе в колонку задерживает механические примеси из подвижной фазы и образцов. Наконечники герметизируют всю колонку и служат для подключения капиллярных трубок, соединяющих колонку с дозатором и детектором. 

       Термостат обеспечивает постоянство температуры. На выходе из колонке обязательно  стоит детектор. Его функция заключается в преобразовании концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический сигнал. Детектор имеет проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны и флуориметрические детекторы. В данном жидкостном хроматографе используется флуориметрический детектор Jasco UV-975 (рис. 4). Его чувствительность 0,0005-2,56 AUFS, диапазон длин волн 190-600 нм. В рассматриваемом случае используется именно флуориметрический детектор потому, что токсические вещества органического происхождения, а именно афлатоксины, обладают природной флуоресценцией.  Принцип действия данного детектора следующий. Ультрафиолетовое излучение от лампы через оптическую систему попадает на дифракционную решётку. Поворотом дифракционной решётки монохроматическое излучение направляется через щель монохроматора на кювету, к которой присоединена хроматографическая колонка. Анализируемое флуоресцирующее вещество, попав в кювету, даёт эмиссионное излучение, которое сферическим зеркалом направляется через светофильтр, отрезающий ненужное излучение. Пройдя светофильтр, эмиссионное излучение регистрируется фотоэлектронным умножителем. Ультрафиолетовое излучение, прошедшее через кювету, поглощается заглушкой.