Определение афлатоксинов, в частности М1, в молочных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

МИНИСТЕРСТВО  ОБРАЗОВАНИЯ И  НАУКИ УКРАИНЫ

ОДЕССКИЙ  ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  ЭКОНОМИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ 
 
 

Кафедра экспертизы товаров и услуг 
 
 

КУРСОВАЯ  РАБОТА

по дисциплине

“Физико-химические (инструментальные) методи исследования

качества  товаров”

по теме

“Определение афлатоксинов, в частности М1, в молочных продуктах

методом высокоэффективной  жидкостной хроматографии” 
 

Исполнитель – ст. III курса 9 группы

факультета  международной экономики

                                      Ткаченко Юлии Григорьевны               ______________

                                                                                                                                               (подпись) 
 
 
 

                                         Проверил руководитель

                           ____________________________________        _____________               

                                                                                                               (подпись) 

“___” ____________ 2009 р.

Дата  защиты

                                           “___” ____________ 2009 р.                _____________                     

      (оценка) 
 
 
 

                       ___________________________________             _____________                       (фамилия, инициалы, должность)                                 (подписи) 
 
 
 
 
 

      Одесса ОГЭУ 2009 г.

Аннотация 
 
 

       Объектом  моей курсовой работы является качественная идентификация и определение содержания вредного для здоровья афлатоксина М1 в молочных продуктах. Выбранная мной тема актуальна потому, что молочные продукты – это основные продукты питания для детей. Дети – это будущее человечества, поэтому забота об их здоровье является важной задачей для настоящего поколения.

       Работа  состоит из: вступления, трех разделов: теоретической части, апаратура для высокоэффективной жидкостной хроматографии, расчётно-графической части и списка литературы.

       Общий объем работы составляет 29 печатных страниц. При написании работы основными источниками были: Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. – Рига: Зинатне. – 1988. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Содержание 

Введение  4

1 Раздел. Теоретическая часть

1.1.Происхождение афлатоксинов и их потенциальная опасность для здоровья человека  5

1.2. Теоретические основы высокоэффективной жидкостной хроматографии  10

2 Раздел. Аппаратура для ВЭЖХ  14

3 Раздел. Расчётно-графическая часть  18

3.1. Методика  по обнаружению, идентификации  и определению содержания афлатоксина  М1 в молочных продуктах с  помощью высокоэффективной жидкостной  хроматографии  18

3.2. Анализ  экспериментальных данных  22

Выводы  26

Список  литературы  28 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение 
 

     Онкологические  заболевания уже давно приобрели  характер эпидемии в мировом масштабе. Смертность от злокачественных опухолей больше, чем от ВИЧ-инфекции, туберкулеза и малярии вместе взятых. Причиной развития рака является повреждение структуры ДНК канцерогенами. Канцерогены – это химические вещества или физическое влияние, способствующее развитию злокачественных опухолей в организме и поступающие в организм человека из внешней среды.

     Одними  из сильнейших канцерогенов являются продукты жизнедеятельности плесневых  грибов. Они называются микотоксинами. На сегодняшний день известно множество  разновидностей микотоксинов, но среди  них выделяется группа афлатоксинов. Из всех биологически производимых ядов, афлатоксины являются самыми сильными гепатоканцерогенами из обнаруженных на сегодняшний день: смерть наступает в течение нескольких суток из-за необратимых поражений печени. Высокой токсичностью обладают афлатоксины В1, В2, G1, G2, а также М1. Целью данной курсовой работы является качественная идентификация и определение содержания афлатоксина М1 в молочных продуктах. Афлатоксин М1 - это вторичный метаболит, который получается из афлатоксина В1, вырабатываемый плесневыми грибами Aspergillus flavus. Он содержится в молоке животных, которые употребляли корм, заражённый В1.

     Основными потребителями молока и молочных продуктов являются дети. Их иммунитет  находиться на стадии формирования, поэтому  организм более восприимчив к неблагоприятным воздействиям внешней среды. Рак у детей возникает в 2,5 раза чаще, чем у взрослых. Необходимо эффективно противостоять распространению онкологических заболеваний среди детей потому, что дети – будущее человечества.

    На  сегодняшний день с распространением рака среди детей можно бороться путём повышения иммунитета и профилактики. Важнейшей процедурой профилактики рака является снижение воздействия канцерогенных веществ на организм. Поэтому целесообразно установить граничные значения содержания афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах как исключительно опасного канцерогена,  и проверять на соответствие с установленным значением содержания афлатоксина М1 молочные продукты, предназначенные, в первую очередь, для потребления детьми. В соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 для молока и молочных продуктов установлена предельно допустимая концентрация афлатоксина М1 на уровне 0,5 мкг/л. 

1 Раздел. Теоретическая часть  
 

1. Происхождение афлатоксинов и их потенциальная опасность для здоровья человека

 
 

    Молоко  – это продукт деятельности молочных желез млекопитающих. Молоко различается  по:

     - происхождению (коровье, овечье и т.д.);

    - виду пастеризации (нагревом или  другая обработка, дающая те же эффекты);

    - содержанию жира (цельное [около  3,5% жирности]; полужирное [жирность не менее 1,5% и не более 1,8%]; обезжиренное [менее 0,3% жира ])

        Все виды молока должны отвечать  соответствующим законодательным  требованиям и запросам потребителя.

        В молоке контролируют содержание  афлатоксина М1. Это вещество является метаболитом афлатоксина В1 и наиболее часто обнаруживается зимой, когда животному дается корм из зерновых культур и кукурузы, хранимых во влажных условиях.

    Афлатоксины продуцируются грибами рода Aspergillus, а именно A.flavus и A.parasiticum. Для развития их жизнедеятельности оптимальными условиями являются t = 20–30ºС, влажность 60-100 % и субстрат, богатый жидкими жирами (маслами). Они образуют колонии различных оттенков зелёного цвета. Развитие этих грибов и продуцирование афлатоксинов наиболее часто происходит в орехах арахиса и арахисовой муке. Кроме того, они выявлены и в ряде других злаковых культур, а также в бобовых и масличных культурах, зернах какао, кофе, в молоке, мясе, яйцах. [12]

    Афлатоксины в больших дозах ядовиты и  вызывают гибель животных, а в малых — опухоли печени. Главная опасность состоит в том, что при термической обработке продуктов, пораженных этим грибком, токсин, который он выделяет в продукт, не разрушается. Заподозрить наличие афлатоксина в продуктах можно визуально, заметив колонии зелёного цвета, и по горькому вкусу.

    Афлатоксины обладают сильнейшим гепатотоксическим  и гепатоканцерогенным действием. Они могут накапливаться в  печени и способствовать возникновению  опухолей, провоцировать мутации  в клетках. Отмечено имунно-депрессивное действие афлатоксинов – снижение общих защитных сил организма.

    На  сегодняшний день известны такие  виды афлатоксинов, как В1, В2, G1, G2, М1 и М2. В естественных условиях встречаются 4 афлатоксина: афлатоксины В1, В2  и афлатоксины G1, G2. [14]

    Самым опасным является афлатоксин В1. Острая интоксикация афлатоксином В1 у большинства  животных отличается быстрым развитием  симптомов и высокой смертностью; клиническая картина острого  отравления характеризуется вялостью, нарушением координации движений, судорогами, парезами, нарушением функции желудочно-кишечного тракта, геморрагиями, отеками, потерей веса и отставанием в развитии. Во всех случаях острой интоксикации органом - мишенью является печень, в которой развиваются некрозы и пролиферация эпителия желчных протоков, а при хронической интоксикации — цирроз, первичный рак печени.

    Широкое распространение афлатоксинов в  растительных продуктах питания, возможное  накопление в продуктах животного  происхождения и почти повсеместное обнаружение их продуцентов создает опасность для здоровья человека. Острые отравления афлатоксинами у человека приводят к поражению печени, а также нервной системы – могут наблюдаться судороги, параличи и нарушения координации движений. При хроническом афлатоксикозе также преимущественно поражается печень. Афлатоксины попадают в кориа для животных из следующих источников:

• из видимо заплесневелого сырья;
• из сырья без видимой плесени;
• из растительных продуктов, в которых присутствие плесени не доказано;

    1. Сырье с заметной плесенъю (видимо заплесневелое сырье). Сильно пораженные плесенью продукты растительного происхождения не представляют собой значительного интереса, так как обычно мы не употребляет их в пищу. Однако при развитии плесени в мешках с мукой, зерном, в силосе возникает возможность попадания плесени в корм животных. В России встречается кормление животных силосом с плесенью, что приводит к попаданию афлатоксинов в мясо и молоко.

    2. Сырье без видимой  плесени. К этой группе относятся плоды, на которых между семядолями может появиться плесень. Например, арахис или чечевица, орехи в скорлупе, косточковые плоды, ядра персиковых и абрикосовых косточек, миндаль, каштаны или мускатные орехи нередко содержат незамеченную, образующую афлатоксины, плесень. Афлатоксины в пораженном сырье распределяются  неравномерно. По российским нормам доза афлатоксина В1 не должна превышать 0,005 мг/кг продукта, в ФРГ - 0,01, а в США - до 0,02 мг/кг.

    3. Растительные продукты, в которых присутствие  плесени не установлено. Поверхностный налет плесени легко удаляется, а при хорошей очистке сырья мицелий и жизнеспособные споры могут почти или вовсе отсутствовать, Однако в таком сырье и изготовленных из него продуктах могут содержаться токсины. Дело в том, что в процессе переработки афлатоксины не разрушаются, в лучшем случае при сортировке удаляются наиболее пораженные, измененные участки или частицы продукта. Поэтому целенаправленное исследование сырья или продуктов на наличие афлатоксинов и других токсинов позволяет обнаружить «замаскированные» микотоксины. Имеются данные о присутствии афлатоксинов в пасте из арахиса (ореховом масле), белом вине, в сухом концентрате супа из гороховой муки и в пшеничной муке и даже пироге с фруктами.

При употреблении дойными коровами кормов, загрязненных афлатоксином В1 частично (до 0,1 - 0,8%) выделяется с молоком в виде афлатоксина М1.

Это вещество является метаболитом афлатоксина В1 и  наиболее часто обнаруживается зимой, когда животному дается корм из зерновых культур и кукурузы, хранимых во влажных условиях. [12]

    При приготовлении сыра  из зараженного  молока содержание афлатокисна М1 может  в 3-5 раз превосходить уровень загрязнения исходного молока.

    При этом его структура меняется (рис.1, 2).

      

    Рис. 1. Структура афлатоксина В1

    

    Рис. 2. Структура афлатоксина М1

    Молекулярная  масса афлатоксина М1– 328, температура  плавления 299ºС, lмакс, нм – 265, 357, флуоресценция, нм – голубой, 425.

    Были  проведены специальные исследования по кормлению коров кормом, содержащим афлатоксин В1 в количестве 500 мкг/кг. В 69% проб сухого обезжиренного молока и 64% сухого цельного молока обнаруживали содержание афлатоксина М1 до 4 мкг/л. Афлатоксин появляется в молоке в течение нескольких часов потребления и возвращаются к начальному уровню в течение двух или трех дней после удаления из рациона.